1  范圍

　　本標準規定了用高效液相色譜儀測定飼料中磺胺二甲基嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶含量的方法。

　　本標準適用于配合飼料、濃縮飼料、添加劑預混合飼料中磺胺二甲基嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶的測定，最低檢出濃度為20 mg／kg。

　　2  規范性引用文件

　　下列文件中的條款，通過本標準的引用而成為本標準的條款，凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內容)或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據本標準達成協議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。

　　GB／T 6682  分析實驗室用水規格和試驗方法

　　GB／T 14699．1  飼料采樣方法

　　3  原理

　　試樣中磺胺二甲基嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶經酸性甲醇溶液超聲提取后，注入高效液相色譜儀反相色譜系統中進行分離，用紫外檢測器(或二極管矩陣檢測器)檢測，外標法計算磺胺二甲基嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶的含量。

　　4  試劑和溶液

　　除特殊說明外，所用試劑均為分析純，水為蒸餾水；色譜用水符合GB／T 6682中一級用水規定。

　　4．1  冰乙酸：優級純。

　　4．2  鹽酸。

　　4．3  鹽酸溶液c(HCI)一0．1mol／L：取鹽酸(4．2)8．5mL，溶解于1000mL水中。

　　4．4  乙腈：色譜純。

　　4．5  甲醇：色譜純。

　　4．6  N，N-二甲基甲酰胺。

　　4．7  提取液：在1000mL容量瓶中加入鹽酸溶液(4．3)300mL，用甲醇(4．5)定容至刻度，搖勻。

　　4．8  流動相：在1000mL容量瓶中加入700mL～800mL去離子水，移取冰乙酸(4．1)3mL加入水中，用水定容至刻度，搖勻，過0．45μm濾膜。取上述溶液880mL與乙腈(4．4)120mL混合，搖勻，脫氣，待用。

　　4．9  磺胺二甲基嘧啶標準品：純度均應大于97％。

　　4．10  磺胺間甲氧嘧啶標準品：純度均應大于97％。

　　4．11  磺胺二甲基嘧啶標準溶液

　　4．11．1  磺胺二甲基嘧啶標準貯備液：準確稱取已知純度的磺胺二甲基嘧啶標準品1 00 mg，精確至0．0001g，置于一只100mL棕色容量瓶中，加2mLN，N-甲基酰胺(4．6)及少量甲醇(4．5)超聲使之完全溶解，用甲醇(4．5)定容至刻度，搖勻，該溶液中磺胺二甲基嘧啶濃度為1mg／mL，于冰箱4μ保存可使用1個月。

　　4．11．2  磺胺二甲基嘧啶標準中間液：準確移取標準貯備液(4．11．1)5mL于一只50mL棕色容量瓶中，用甲醇(4．5)定容至刻度，該溶液中磺胺二甲基嘧啶的濃度為100μg／mL，于冰箱4℃保存可使用半個月。

　　4．11．3  磺胺二甲基嘧啶標準工作液：準確移取標準中間液(4．11．2)5 mL于一只50mL棕色容量瓶中，用流動相(4．8)定容至刻度，該溶液中磺胺二甲基嘧啶濃度為10μg／mL，當日使用。

　　4．12  磺胺間甲氧嘧啶標準溶液：配制過程同磺胺二甲基嘧啶。

　　注：若同時測定兩種磺胺可配制混合標準工作液。

　　4．13  磺胺二甲基嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶混合標準工作液

　　分別移取磺胺二甲基嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶標準中間液5 mL于一只50 mL棕色容量瓶中，用流動相(4．8)定容至刻度，該溶液中磺胺二甲基嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶的濃度均為10μg／mL，當日使用。

　　5  儀器

　　5．1  實驗室常用儀器設備。

　　5．2  具塞錐形瓶，150mL。

　　5．3  振蕩器。

　　5．4  高效液相色譜儀：配自動進樣器、紫外檢測器(或二極管矩陣檢測器)。

　　5．5  針頭過濾器：備孔徑為0．45μm(或0．20μm)微孔濾膜。，

　　6  試樣制備

　　選取有代表性飼料樣品至少500g，四分法縮減至100g，磨碎，全部通過0．28mm孔篩，混勻，裝入密閉容器中，避光低溫保存備用。

　　7  分析步驟

　　7．1  試樣溶液的制備

　　稱取飼料樣品5g(精確至0．001 g)置于具塞錐形瓶(5．2)中，加入100mL的提取液(4．7)，于振蕩器(5．3)振蕩提取30min，過濾，濾液過0．45μm濾膜(5．5)，待上機。

　　7．2  色譜條件

　　7．2．1  固定相  具有C18填料的柱子(粒度為4μm)：柱長150mm，內徑3．9mm。

　　7．2．2  流動相  12％乙腈溶液(4．8)，以1．0mL／min流速洗脫。

　　7．2．3  進樣量  20μL。

　　7．2．4  檢測器  紫外檢測器(或二極管矩陣檢測器)，檢測波長270nm。若單獨測定，磺胺二甲基嘧啶檢測波長可選為266 nm；磺胺間甲氧嘧啶檢測波長可選為271nm。

　　8  定量測定

　　按高效液相色譜儀器說明書調整儀器操作參數。向色譜柱中注入磺胺二甲基嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶標準工作液(4．13)及試樣溶液(7．1)，得到色譜峰面積響應值，用外標法定量。

　　9  結果計算

　　9．1  試樣中磺胺二甲基嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶的含量分別按式(1)計算：

　　…………………………………………………..（1）

　　式中：

　　Wi試樣中磺胺二甲基嘧啶或磺胺間甲氧嘧啶的含量，單位為毫克每千克(mg／kg)；

　　Pi——試樣溶液峰面積值；

　　V——樣品的總稀釋體積，單位為毫升(mL)；

　　fi——標準溶液濃度，單位為微克每毫升(μg／mL)；

　　Vst——標準溶液進樣體積，單位為微升(μL)；

　　Psti——標準溶液峰面積平均值；

　　m——試樣質量，單位為克(g)；

　　Vi——試樣溶液進樣體積，單位為微升(μL)。

　　9．2  平行測定結果用算術平均值表示，保留兩位有效數字。

　　10  重復性

　　同一分析者對同一試樣同時兩次平行測定結果的相對偏差不大于10％。