飼料摻假原料中非蛋白氮的快速檢測方法探討

007畜牧 2013-11-7 09:20

803 原作者: 007畜牧

簡介

　　摘要：本文主要探究飼料摻假原料中主要幾種非蛋白氮的快速定性檢測方法，包括尿素、銨鹽、硝酸鹽-亞硝酸鹽、尿醛聚合物、生物蛋白精、三聚氰胺的快速定性檢測。快速定性檢測方法在實(shí)際原料摻假檢測工作中 ...

　摘要：本文主要探究飼料摻假原料中主要幾種非蛋白氮的快速定性檢測方法，包括尿素、銨鹽、硝酸鹽-亞硝酸鹽、尿醛聚合物、生物蛋白精、三聚氰胺的快速定性檢測。快速定性檢測方法在實(shí)際原料摻假檢測工作中與其標(biāo)準(zhǔn)檢測方法比較更簡便、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、結(jié)果直觀、選擇性強(qiáng)，是一種實(shí)用性強(qiáng)、易推廣的飼料摻假原料中非蛋白氮的檢測方法。
　　關(guān)鍵詞：非蛋白氮；尿素；銨鹽；硝酸鹽-亞硝酸鹽；尿醛聚合物；生物蛋白精；三聚氰胺
　　飼料是發(fā)展畜牧業(yè)的物質(zhì)基礎(chǔ)，飼料中所含的營養(yǎng)物質(zhì)及有害物質(zhì)直接影響畜禽產(chǎn)品的質(zhì)量，進(jìn)而影響人類健康。近年來，由于對原料的使用處理不當(dāng)，二噁英、瘦肉精、蘇丹紅等由飼料安全問題引發(fā)的畜產(chǎn)品安全問題不斷出現(xiàn)，已成為全球性關(guān)注的社會和政治問題，因而飼料原料的檢驗(yàn)工序已是飼料生產(chǎn)中的重要程序。實(shí)驗(yàn)以大量的生產(chǎn)實(shí)踐為基礎(chǔ)，探究出更為實(shí)用、簡便、快速、準(zhǔn)確的測定飼料原料中非蛋白氮的檢測方法，為以后飼料檢測水平的改進(jìn)提供理論依據(jù)。
　

　1 檢測方法
　　對部分樣品進(jìn)行脫脂，脫脂有兩種方法，包括慢速脫脂和快速脫脂。
　　慢速脫脂：粗稱取樣品10g，把樣品用濾紙包好，把濾紙包放入燒杯并加入石油醚，浸泡脫脂2～3h。然后取出濾紙包，將濾紙包放入通風(fēng)櫥中，把石油醚揮發(fā)干凈。
　　快速脫脂：粗稱取樣品10g，把樣品直接放入一個100mL小燒杯中，加30～40mL石油醚浸沒樣品，充分?jǐn)嚢瑁葺腿?5min左右。然后把上清液倒掉，用濾紙過濾，收集脫脂樣品。把脫脂樣品放通風(fēng)櫥中，使石油醚揮發(fā)干凈。
　　1.1 尿素、銨鹽、硝酸鹽-亞硝酸鹽的快速定性檢測
　　粗稱2g上述脫脂樣品于試管中，加10mL蒸餾水，用渦旋混合器混合10～15s，靜置10min，取用上清液測非蛋白氮。
　　1.1.1 尿素的快速定性檢測
　　尿素是一種白色、易潮解的結(jié)晶固體，純尿素含氮量為46.6%（折合粗蛋白質(zhì)含量291.3%）。這是最簡單的非蛋白氮類化合物。是生產(chǎn)中使用范圍最廣、時間最長、用量最大的一種非蛋白氮。1kg尿素相當(dāng)于2.88kg粗蛋白質(zhì)，相當(dāng)于7kg大豆餅。
　　快速檢測尿素有兩種方法。
　　第1種方法：先加6～8滴上清液到白色點(diǎn)滴板上，然后加2～3滴0.1%溴百里酚蘭和4～5滴0.4%尿素酶到白色點(diǎn)滴板上，觀察顏色變化情況。若為陽性反應(yīng)結(jié)果呈藍(lán)色，陽性最低檢測限是0.25%。
　　第2種方法：取試樣5g左右，置于一張干凈的濾紙上，再加入5g左右的生豆粉，攪拌均勻，用蒸餾水潤濕，滴入數(shù)滴甲酚紅試劑，讓其反應(yīng)3～5min，若有尿素存在即顯出紅色，且散開得像蜘蛛網(wǎng)似的，無尿素則顯出黃色。
　　1.1.2 銨鹽快速定性檢測
　　加6～8滴上清液到點(diǎn)滴板上，然后滴加2～3滴奈斯勒試劑，觀察顏色變化結(jié)果。陽性反應(yīng)的結(jié)果：開始為黃色，逐漸變?yōu)樯罱凵粫妥兓疑糁怀霈F(xiàn)深桔色、基本不變色或由黃色直接變?yōu)榛疑蚝芸熳優(yōu)榛疑瑒t是陰性。最低檢測限是0.1%。
　　1.1.3 硝酸鹽-亞硝酸鹽的快速定性檢測
　　加6～8滴上清液到點(diǎn)滴板上，然后加2～3滴0.5%二苯胺，觀察顏色變化結(jié)果。陽性反應(yīng)的結(jié)果：在點(diǎn)滴板中間是深藍(lán)色，最低檢測限是0.05%。
　　1.2 脲醛聚合物的快速定性檢測
　　快速檢測脲醛聚合物有兩種方法。
　　第1種方法適用范圍：動物性原料和植物性原料
　　動物性原料脫脂（植物性原料不用脫脂），樣品過45目篩，加6～8滴0.5%變色酸到點(diǎn)滴板上，取一些篩下樣品也加到點(diǎn)滴板上，往點(diǎn)滴板上再加0.5%變色酸，觀察顏色變化結(jié)果。陽性反應(yīng)的結(jié)果：在5～10min內(nèi)，出現(xiàn)藍(lán)紫色，最低檢測限是0.15%。
　　第2種方法適用范圍：僅動物性原料
　　稱3g樣品加到50mL帶蓋離心管中，加35mL煮沸的20% NaOH溶液，用渦旋混合器混勻，靜置大約5min，倒掉上清液，留下底部沉淀，加35mL蒸餾水，混合，靜置5min，倒掉上清液，反復(fù)洗3～4次，洗到沉淀無色（白到灰色），用蒸餾水將沉淀轉(zhuǎn)移到10mL的試管中，吸出試管內(nèi)大部分水，僅留1cm高的水。加1mL 0.5%變色酸，混勻，再觀察顏色。陽性反應(yīng)的結(jié)果：藍(lán)紫色，最低檢測限是0.25%。
　　1.3 生物蛋白精的快速定性檢測
　　蛋白精又叫蛋白胨，是一種脲醛樹脂聚合物（CO（NH2）2+CH2O），主要用于工業(yè)生產(chǎn)。生物蛋白精的最大特點(diǎn)是含氮量高（可達(dá)66%）、價格低。在飼料中少量摻入就可以迅速提高其“蛋白”含量。如果在飼料中，每增加1個百分點(diǎn)的生物蛋白精，會使用“凱氏定氮法”測定的表觀粗蛋白質(zhì)虛漲4個以上的百分點(diǎn)。生物蛋白精添加到飼料中，由于其本身沒有任何營養(yǎng)價值，不能被動物所吸收，它們降低了飼料中真蛋白質(zhì)的含量，影響了動物性能，甚至可能對動物產(chǎn)生危害。據(jù)有關(guān)研究表明，動物若食用含有較高濃度“蛋白精”的飼料后，可以使動物發(fā)生腎衰竭并導(dǎo)致死亡。
　　生物蛋白精的檢測方法：將樣品過45目篩，取一些篩下樣品加點(diǎn)滴板上，加0.5%二苯胺，覆蓋住樣品，在顯微鏡幾倍鏡下觀察結(jié)果。陽性結(jié)果：漂浮著灰白色小顆粒，有時偏黃色，不光滑，表面好像是魚子樣的小突起狀的晶體，最低檢測限是0.1%。
　　1.4 三聚氰胺的快速定性檢測
　　三聚氰胺俗稱蜜胺，又稱氰尿酰胺、三聚氰酰胺，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，是重要的尿素后加工產(chǎn)品，其含氮量達(dá)66.88%左右（折合粗蛋白含量418%）。三聚氰胺是一種用途廣泛的有機(jī)化工原料，但在飼料中添加，不僅對養(yǎng)殖業(yè)具有不良影響，還對人類健康存在著嚴(yán)重威脅。三聚氰胺本身在劑量很低時是無毒的，但當(dāng)和三聚氰酸結(jié)合后能夠生成不溶于水的異氰尿酸蜜胺鹽，易引起腎結(jié)石，并具有致命性。
　　快速檢測三聚氰胺有兩種方法。
　　第1種方法：（0.5%二苯胺/奈斯勒試劑法）
　　樣品過45目篩，取一些篩下樣品加到點(diǎn)滴板上，加0.5%二苯胺，覆蓋樣品，在顯微鏡鏡下用低倍鏡觀察，三聚氰胺是乳白色顆粒。
　　通過下面的方法確定三聚氰胺陽性結(jié)果：
　　從脫脂的篩下樣品中挑出疑似的晶體，夾到點(diǎn)滴板上。加2滴75%H2SO4 ，等1min，再加5滴奈斯勒試劑，等3～5min，在顯微鏡下觀察顏色變化結(jié)果，陽性反應(yīng)的結(jié)果：亮橙色顆粒，最低檢測限是0.05%。
　　第2種方法：（三聚氰酸法）
　　僅動物性原料
　　粗稱10g樣品于100mL小燒杯中，加30～40mL石油醚，充分?jǐn)嚢瑁葺腿?5min左右。然后把上清液倒掉，用濾紙過濾，收集脫脂樣品。把脫脂樣品放通風(fēng)櫥中，把石油醚揮發(fā)干凈。把樣品過45目，稱取4g樣品，將篩下樣品加到一個離心管中，加10mL 40%乙醇，蓋上蓋子，用震蕩器震蕩5min，150r/s，離心，3 000r/min，10min，用濾紙過濾，加1mL飽和三聚氰酸溶液，觀察反應(yīng)結(jié)果。陽性結(jié)果：白色霧狀沉淀。最低檢測限：魚粉/魚頭粉/雞肉粉/豬肉粉 0.03%；魷魚肝臟粉 0.05%。
　　僅植物性原料粗稱5g樣品，樣品過45目，將篩下樣品放到一個試管中，加高氯仿至管口部位，萃取3～5min后，倒掉試管中的上浮物和高氯仿，管身傾斜將管內(nèi)壁的固體物一并倒棄，僅留2cm高氯仿即可。再倒入高氯仿少許，轉(zhuǎn)動清洗內(nèi)壁面，片刻后將上面的液體吸出棄去，可反復(fù)清洗3～4次，管底部僅留1mL或更少液體。將試管放烘箱或沸水浴上加熱將氯仿?lián)]發(fā)掉，沉淀干燥，將試管冷卻到室溫，加2mL蒸餾水。加1mL飽和三聚氰酸溶液（60℃左右），觀察反應(yīng)結(jié)果。陽性結(jié)果：白色霧狀沉淀物產(chǎn)生，最低檢測限：菜籽粕/小麥谷朊粉 0.03%；玉米蛋白粉/豆粕/小麥面粉 0.05%。
　

　2 檢測結(jié)果
　　測結(jié)果見表1。

　　

3 討論與結(jié)論
　　在傳統(tǒng)方法中尿素、銨鹽、硝酸鹽-亞硝酸鹽和尿醛聚合物的檢測用分光光度比色法。三聚氰胺檢測方法有試劑盒檢測法（ELISA）、液相檢測法和氣質(zhì)檢測法。這些標(biāo)準(zhǔn)方法操作繁瑣、消耗大、試驗(yàn)周期性長。本文中非蛋白質(zhì)含氮化合物快速檢測方法結(jié)合了感官檢測、顯微鏡檢測、物理、化學(xué)和生物學(xué)檢測，各種檢測方法相輔相成。在實(shí)踐中經(jīng)過多次和傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)常規(guī)檢測方法對比，上述檢測方法更簡便、快速、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、檢測結(jié)果直觀、技術(shù)易掌握，甚至非專業(yè)人員都可掌握，應(yīng)大力提倡。
　　作為飼料工作者尤其檢驗(yàn)人員應(yīng)對各種飼料原料生產(chǎn)工藝流程有一定了解，用上述方法快速檢測原料是否摻有非蛋白氮時，還應(yīng)注意其生產(chǎn)工藝中是否有殘留非蛋白質(zhì)含氮化合物，在實(shí)際快速檢測過程中還應(yīng)注意原料的假陽性問題，如玉米酒精糟中的銨鹽的假陽性和加漿玉米皮中的銨鹽的假陽性，一旦遇到此現(xiàn)象，一定要通過原料鏡檢、試劑鑒別、對比試驗(yàn)和空白試驗(yàn)來共同決定。用0.5%二苯胺檢測生物蛋白精和三聚氰胺時，在顯微鏡下鏡檢時要注意兩者的區(qū)別：兩者都為白色顆粒，但是生物蛋白精要比三聚氰胺發(fā)白，且用探針在顯微鏡下?lián)軇宇w粒時，三聚氰胺為完整顆粒不會散開，而生物蛋白精用探針撥動時會散開。（作者：薛霖莉李耀世）