精制禽流感高免卵黃抗體的研究

2007-7-1 18:34| 發(fā)布者: nety| 查看: 1179| 評論: 2

　禽流感是由流感病毒引起的一種烈性傳染病，對養(yǎng)禽業(yè)構成了嚴重的威脅。將禽流感病毒油乳劑滅活苗按一定的免疫程序給SPF蛋雞強化免疫，制備抗禽流感的高免卵黃液，用于治療禽流感取得了一定的效果。但粗制卵黃液中含有大量脂類及其他的雜蛋白，用于治療時存在注射困難，吸收不良，過敏反應，保存期短和運輸不便”。因此，我們對禽流感高免卵黃抗體進行了純化研究。
    1 材料與方法
    1.1 疫苗禽流感油乳劑滅活苗，中牧股份實業(yè)有限公司鄭州生藥廠，批號030444。
    1.2 禽流感抗原山西省獸醫(yī)防治站提供。
    1.3試驗用動物購自山東省家禽研究所的200日齡SPF產(chǎn)蛋雞和20日齡SPF小雞、太谷縣某養(yǎng)雞場200日齡非免疫產(chǎn)蛋雞30只及健康小鼠10只。
    1.4 免疫方法 SPF產(chǎn)蛋雞肌注禽流感油乳劑滅活苗1mL，首免后7～10d再次用該苗2mL進行二免，二免后每隔3d用HI測定其卵黃效價，當卵黃效價達2E10以上即可收集雞蛋，用于制備卵黃液。以后每隔一定時間強化免疫1次，保證卵黃效價。
    1.5 卵黃液的制備選擇卵黃效價達2E10以上的高免蛋，分離蛋黃與滅菌蒸餾水按1∶1稀釋，充分攪拌，保存?zhèn)溆谩?nbsp;
    1.6 1gY的純化制備好的卵黃液中加入相當與原卵黃體積8倍、4℃預冷的酸性蒸餾水，邊加邊攪拌，4℃保溫靜置過夜，取上清液，上清液用濾布過濾，過濾液進行超濾濃縮，濃縮倍數(shù)為4，所得超濾液中加入硫柳汞至終濃度為0.01%，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，即為精制禽流感高免卵黃抗體。
    1.7 抗體效價檢測采用血凝抑制試驗。
    1.8 無菌檢驗 2.0mL精制禽流感高免卵黃抗體分別接種普通瓊脂培養(yǎng)基、血液瓊脂斜面和厭氧肉湯中，37℃培養(yǎng)48h，觀察有無細菌生長。
    1.9 安全試驗健康小鼠10只，每只皮下注射本品1mL；20日齡SPF小雞10只，每只皮下注射本品5mL，觀察2周。
    1.10 動物試驗取200日齡非免疫產(chǎn)蛋雞30只，隨機分為3組，第1組為健康對照組，不注射任何藥物，隔離飼養(yǎng)。第2和第3組每只雞肌注、點眼、滴鼻接種EID50AIV種毒0.2mL。攻毒后24h分別給第2組雞皮下注射本品2.0mL，第3組皮下注射生理鹽水2.0mL。觀察10d，記錄每組雞發(fā)病、死亡情況。
    1.11 脫脂率與蛋白質回收率的測定用紫外分光光度計測定精制禽流感高免卵黃抗體在A280和A260處的吸光度，按紫外吸收差法測定蛋白質的含量，計算公式：蛋白質濃度（mg/mL）＝（1.45×A280－0.74×A260）。脂肪含量測定采用香草醛顯色法。
    1.12 保存期試驗將精制禽流感高免卵黃抗體分別保存在室溫4℃和～20℃，每月測定一次HI效價。
    2 結果
    2.1 物理性狀應為無色或淡黃色液體，放置一段時間后瓶底有少量沉淀，pH值呈中性。
    2.2 無菌檢驗 2.0mL精制禽流感高免卵黃抗體分別接種普通瓊脂培養(yǎng)基、血液瓊脂斜面和厭氧肉湯中，37～12培養(yǎng)48h，未見有任何細菌生長。
    2.3 安全試驗健康小鼠10只，每只皮下注射本品2mL；20日齡SPF小雞10只，每只皮下注射本品5mL，觀察2周，未發(fā)現(xiàn)任何異常，精神狀態(tài)和生長情況良好，證明精制禽流感高免卵黃抗體是安全可靠的。
    2.4 動物試驗第1組健康狀況良好，無發(fā)病死亡。第3組在攻毒后24～48h開始發(fā)病，出現(xiàn)死亡，72h全部發(fā)病，7d內死亡8只。第2組在注射精制禽流感高免卵黃抗體后12h即攻毒后36h有4只雞發(fā)病，發(fā)病后12～24h，其中1只死亡，其余3只均恢復正常。證明該卵黃抗體確實起到了中和病毒的作用。
    2.5 脫脂率與蛋白質含量沉淀中的脂肪經(jīng)香草醛顯色法測定含量為95.7%，精制卵黃抗體中蛋白質含量經(jīng)紫外吸收差法測定為9.47mg/mL，該純化卵黃抗體的方法去脂效果好，IgY回收率比較高。
    2.6 保存期試驗精制禽流感高免卵黃抗體室溫條件下可保存10個月，4～12條件下保存15個月，-20℃條件下保存18個月。
    3 小結與討論
    3.1 禽流感是Ⅰ類烈性傳染病，一旦發(fā)病，將對養(yǎng)雞業(yè)造成嚴重的威脅，用禽流感油苗免疫蛋雞制備高免卵黃液，給發(fā)病雞注射，隨著抗體的擴散直接中和體內的病毒，使雞體在短時間內獲得迅速保護，發(fā)揮了緊急預防和緊急治療的作用。精制禽流感高免卵黃抗體對200日齡非免疫產(chǎn)蛋雞及20日齡SPF小雞安全可靠，有較好的保護作用，在生產(chǎn)實踐中可以推廣應用。
    3.2 卵黃液中含有大量的脂類和雜蛋白，對IgY的吸收造成影響，經(jīng)過純化去掉了脂類和雜蛋白，純化后的IgY不但易于注射，而且易于吸收，治療效果好。該純化過程采用水稀釋法，在此基礎上加以改進，與PEG沉淀法、氯仿抽提法、硫酸鈉沉淀法等純化方法比較，水稀釋法成本低，易于操作，實驗條件簡單，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
    3.3 現(xiàn)已報道有治療新城疫、法氏囊、禽腦脊髓炎的各種卵黃液，用于治療相應的疾病，取得了較好的治療效果。但禽流感亞型眾多，變異性極強，所以應進行本地毒株分離，制備油苗免疫，這樣制備的卵黃抗體更有針對性，預防和治療的效果會更好。
    3.4 制備卵黃抗體的蛋主要來自普通的產(chǎn)蛋雞，這樣就會造成一些疾病的垂直傳播，可以采用非免疫雞群，排除一些蛋傳疾病，也可將制備好的卵黃抗體進行60Coγ射線輻射滅菌，同樣可以達到滅菌的目的。
    3.5 由于除去了大部分的脂類，精制禽流感高免卵黃抗體的保存期比普通卵黃抗體的保存期延長，給卵黃抗體的運輸和貯藏帶來了方便。
    3.6 從免疫雞卵黃中提取特異性IgY抗體，是一種預防和治療動物和人類某些疾病的優(yōu)質便利的好途徑，在生物制品的開發(fā)和綜合利用方面有廣闊的前景，隨著對IgY制備和純化方法的不斷改進以及研究的不斷深入其應用將進一步擴大。