抗生素由于藥物的殘留、病原菌的耐藥性等問題而逐漸被限制在飼料中使用。因此，尋找綠色安全的抗生素替代物成為當前動物營養研究的熱點。Fang等[1]報道，將1 g/kg刺五加精油添加到21日齡斷奶仔豬的飼糧中，仔豬腸道大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的數量顯著降低。Michiels等[2]研究表明，百里香酚能夠顯著提高仔豬空腸和盲腸中乳酸桿菌的數量，降低空腸中的厭氧菌、梭菌和鏈球菌的數量。丁酸鈉在維持細胞的分化和結腸上皮的完整性、提高動物生產性能方面發揮著重要作用。Kotunia等[3]在3日齡仔豬人工乳中加入丁酸鈉，發現丁酸鈉使空腸和回腸絨毛長度和黏膜厚度增加。Manzanilla等[4]研究表明，飼糧中添加丁酸鈉可以增加斷奶仔豬回腸杯狀細胞的數量。李丹丹等[5]研究表明，飼糧中添加丁酸鈉能促進斷奶仔豬的生長和免疫器官發育，提高血清免疫球蛋白的含量，刺激機體腸道黏膜分泌免疫球蛋白A，提高其免疫功能。王純剛[6]研究發現，在飼糧中添加丁酸鈉可減少仔豬受輪狀病毒感染的應激反應。植物精油具有抑菌效果，可抑制腸道致病菌的增殖，進而促進動物健康生長。目前對于植物精油、丁酸鹽的研究大多是對其單一特性的分析，而對于植物精油與丁酸鹽的協同作用方面的研究相對較少。本試驗通過體外抑菌試驗尋求抑菌效果最好的植物精油，并且研究植物精油與丁酸鈉的協同作用，旨在為進一步開發新型綠色飼料添加劑提供理論依據。
1 材料與方法肉桂醛(淡黃色液體)、百里香酚(無色半透明結晶)、香蘭素(白色粉末)、丁酸鈉(白色粉末)，均由浙江萬方生物科技有限公司提供，試驗前置于4 ℃冰箱、避光條件下保存。
大腸桿菌(ATCC 25922)、沙門氏菌(CICC 21913)、產氣莢膜梭菌(ATCC13124)均購自廣東省菌種保藏中心，乳酸桿菌(ATCC 7469)購自中國工業微生物菌種保藏中心。
1.2 試驗設計1.2.1 抑菌試驗抑菌試驗采用牛津杯法。培養基表面放5個滅菌牛津杯，分別加入3種精油(百里香酚、肉桂醛、香蘭素，添加量均為16 mg/mL)，并加入95%乙醇做空白對照，加入硫酸黏桿菌素(1 280 μg/mL)做陽性對照。每個菌種做3個平行，放入37 ℃的生化培養箱中培養24 h。
1.2.2 最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)及復合植物精油抑菌試驗通過牛津杯篩選獲得初步抑菌效果較佳的植物精油，采用梯度稀釋法測定植物精油的MIC。
復合植物精油由肉桂醛和香蘭素組成，抑菌試驗中肉桂醛和香蘭素按梯度比例(6:1、4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:6，質量比)進行復合制劑的配制，并尋求最佳的比例。
1.2.3 植物精油與丁酸鈉的協同抑菌試驗按照1.2.1 的試驗方法，在滅菌牛津杯分別加入植物精油(16 mg/mL)、丁酸鈉溶液(2.2 mg/mL)、植物精油+丁酸鈉(1:1，質量比)，并以95%乙醇做空白對照，以硫酸黏桿菌素(1 280 μg/mL)做陽性對照。每個菌種做3個平行，然后放入37 ℃的生化培養箱中恒溫培養24 h。
1.3 數據處理數據采用Excel 2003進行統計分析，以平均值±標準差表示。
2 結果與分析由表 1和圖 1可知，肉桂醛和香蘭素對大腸桿菌、沙門氏菌和產氣莢膜梭菌都有很強的抑制作用。此外，硫酸黏桿菌素是腸道細菌敏感的抗生素之一，對于大腸桿菌、沙門氏菌和乳酸菌都具有敏感性，可抑制其增殖。
由表 2和圖 2可知，肉桂醛、肉桂醛與丁酸鈉1:1混合對大腸桿菌、沙門氏菌和產氣莢膜梭菌的抑制效果大致相同，表明丁酸鈉與植物精油復配可以減少至少50%的精油用量。
由表 3和圖 3可知，肉桂醛對產氣夾膜梭菌的抑菌作用最強，其次為沙門氏菌，對大腸桿菌的最低抑菌濃度為312.50 μg/mL；香蘭素對產氣夾膜梭菌的抑菌作用較強，對大腸桿菌和沙門氏菌的最低抑菌濃度均為625.00 μg/mL。肉桂醛與香蘭素1:1復合時的抑菌效果優于單獨使用香蘭素。
由表 5和圖 5可知，肉桂醛與香蘭素的復合植物精油和復合植物精油與丁酸鈉1:1、1:2、1:3混合物對大腸桿菌、沙門氏菌和產氣莢膜梭菌的抑制效果大致相同，表明復合植物精油和丁酸鈉之間也存在協同作用，在保持相同抑菌效果的前提下，丁酸鈉能夠減少75%的復合植物精油的使用量。
某些植物精油具有較強的抑菌效果已經被很多報道和研究所證實，汪中興等[7]檢測了3種可飼植物精油(肉桂油、牛至油和百里香油)在一定配比下對豬源產腸毒素大腸桿菌K88和霍亂沙門菌A72的體外抑菌作用，結果表明抑菌效果為：肉桂油>牛至油>百里香油。張赟彬等[8]通過對植物精油的主要化學成分進行分析總結，發現許多植物精油的成分中包含苯環或者共軛雙鍵結構，例如肉桂醛、香蘭素以及檸檬醛等，這種結構通過結合微生物細胞膜表面的離子通道蛋白，從而改變細胞膜的通透性，加速菌體代謝致使細菌死亡。本試驗的研究結果發現肉桂醛表現出很強的抑菌作用，香蘭素的抑菌作用次之，百里香酚最弱。
現有對于植物精油的協同性的研究大致體現在2個方面，其中一方面為不同植物精油之間的協同。復合植物精油由于含有不同組分，能夠多途徑、多靶位發揮協同效應，整體的作用效果一定程度上強于單方植物精油。Imming等[9]枚舉了植物精油進入機體后其所有可能的靶作用點，其中有代謝酶、基質、轉運載體、蛋白質、受體、細胞因子、DNA/RNA等。Galindo等[10]研究發現，植物精油中的多酚類物質，雖然其本身的物理特性較為模糊，卻能夠通過提高主要活性物質的溶解度和吸收率來增強整體的作用效果。而醛類物質，能夠穿透細胞膜，與細胞質內的蛋白質結合，從而抑制關鍵酶的活性，達到抑菌的效果[11]。例如，Roldán-Gutiérrez等[12]的研究發現植物精油的復合效應能夠抵抗大多數致病細菌，如單增李斯特菌，這種菌對所有單一植物精油都有一定的耐受性，復合植物精油能夠更好地抑制其生長，同時多種植物精油復合可以減少植物精油的添加量，并增強其抑菌效果。Bassolé等[13]研究表明，相比于單獨使用香芹酚(瓦解細胞外膜)和百里香酚(結合菌體蛋白)的抑菌效果，綜合了兩者的野薔薇精油的抑菌效果更佳。Bozkurt等[14]研究發現，將含有香芹酚、百里酚、桉樹腦和檸檬烯的植物精油混合物添加到蛋雞的基礎飼糧中，能夠有效緩解應激，降低死亡率。Arczewska-Wlosek等[15]指出，混合植物精油(含百里香酚、大蒜精油)能夠緩解肉雞染艾美爾球蟲病的病情。Rahimi等[16]研究發現，百里香酚、紫雛菊和大蒜精油的混合物可顯著減少肉仔雞回腸、盲腸中大腸桿菌的數量。目前發現的植物精油中有協同增效作用的成分很多，常見的復配組合有肉桂醛和香蘭素、紫蘇醛和蓼二醛等，通過復配都可以降低各自的MIC[17]。植物精油在動物腸道健康的保健和治療上的應用更為常見，劉容珍等[18]認為選對合適的植物精油組合，可以用最少的劑量達到最大的收益，同時能夠減輕或消除潛在的副作用。因此，研究植物精油及其主要成分之間抑菌作用的協同性有著重要的科學意義。本試驗首次發現肉桂醛和香蘭素的配比為6:1時對大腸桿菌、沙門氏菌和產氣莢膜梭菌的抑制效果最強。
植物精油的協同性研究的另一方面是將復合植物精油和其他抑菌物質聯用，從而提高其抑菌活性。Bassolé等[13]在野薔薇精油中發現除主要抑菌物質(香芹酚和百里香酚)外，薄荷酮、桉樹腦等也在強化整體的抑菌效果。王繼鳳等[19]發現，丁酸鈉在一定程度上，在不影響抑菌效果的作用下，能夠減少一部分抗生素的用量，且與抗生素存在協同效應。王帆等[20]的體外試驗表明，復合植物精油與單寧酸進行復配能夠對5種常見致病菌(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、腸炎沙門氏菌和單增李斯特菌)均產生較強的抑制作用，且復配后各成分的MIC都有降低。找到合適的配比，能夠使得復合植物精油的抗菌活性增強，并且能夠減少的精油的使用量。李凱年[21]研究發現，飼料添加劑Natesse(含有丁酸鈉和組合精油)可以減少肉雞卵囊的排泄。齊勝利[22]的研究認為，在植物精油中添加丁酸有助于增強植物精油中活性成分的抗菌作用。Jerzsele等[23]試驗也表明，在肉雞的飼糧中添加香精油或者是丁酸鈉與植物精油的混合物后小腸絨毛長度/隱窩深度值得到極其顯著提高，并且產氣莢膜梭菌的數量顯著減少。本試驗結果表明，復合植物精油和丁酸鈉之間存在協同作用，丁酸鈉的加入能夠減少75%的復合植物精油(肉桂醛與香蘭素以6:1的質量比復合)的使用量，同時淡化了植物精油的濃郁氣味。
4 結 論肉桂醛和香蘭素組成的復合植物精油對大腸桿菌、沙門氏菌和產氣莢膜梭菌的抑制作用比單方植物精油更強，2種單方植物精油之間存在協同效應，最適配比為6:1。丁酸鈉與植物精油之間存在協同作用，并且能夠減少75%的復合植物精油(肉桂醛與香蘭素以6:1的質量比復合)的使用量。
作者：韓乾杰, 張玲玲, 陳敏, 李慧, 范小燕, 楊彩梅
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