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畜牧人

標(biāo)題: 不同方法測定大豆脲酶活性的比較研究 [打印本頁]

作者: 胡文輝 時間: 2009-7-27 10:49
標(biāo)題: 不同方法測定大豆脲酶活性的比較研究

楊奇慧舒璐鐘劍鋒

摘要

用滴定法和增值法測定了大豆粉在85℃和140℃下分別熱處理0，45，90，135，180min的脲酶活性, 并用0.2%KOH溶解法測定大豆粉在不同熱處理下的蛋白質(zhì)溶解度。結(jié)果表明, 在85℃條件下，處理0-180min 大豆粉的脲酶活性和蛋白質(zhì)溶解度隨著時間的延長無明顯變化，而在140℃下，大豆粉的脲酶活性和蛋白質(zhì)溶解度隨著處理時間的延長顯著降低。通過測定結(jié)果的比較可見，同一樣品用滴定法和增值法測得的脲酶活性在數(shù)值上不相等, 不能互用，但蛋白質(zhì)溶解度更能反映大豆粉受熱過度的程度。

關(guān)鍵詞：大豆粉；脲酶活性；蛋白質(zhì)溶解度； pH增值法；滴定法

眾所周知，大豆含有較豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等，是飼料生產(chǎn)中主要的植物蛋白源之一，具有較高營養(yǎng)價值[1]。然而，大豆中含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，如蛋白酶抑制因子、植物凝集素、胃腸脹氣因子、抗維生素因子、抗原蛋白等[2]。由于這些抗?fàn)I養(yǎng)因子在大豆產(chǎn)品中具有較高的生物活性，阻礙營養(yǎng)物質(zhì)在動物體內(nèi)的利用[3]，尤其是胰蛋白酶抑制因子的存在不僅會降低飼料營養(yǎng)成分的消化率和適口性，且影響動物對蛋白質(zhì)的消化吸收，對動物生長發(fā)育也產(chǎn)生不良的影響。然而，胰蛋白酶抑制因子的測定較困難，且豆粕中脲酶活性與胰蛋白酶抑制因子活性呈正相關(guān)，所以通常通過測定脲酶活性來反映蛋白酶抑制因子的活性[4]。

脲酶活性定義為：在30±0.5 ℃和pH為7的條件下，每分鐘每克大豆制品分解尿素后，所釋放氨態(tài)氮的毫克數(shù)[5]。目前，脲酶活性的測定方法有滴定法(國標(biāo)法)、pH增值法，快速測定法等[5，6]。

目前，對脲酶活性不同測定方法及結(jié)果間的差異性的研究較少[7-8]，本文擬對兩種方法進(jìn)行研究，以比較不同方法對測定結(jié)果的影響，為實際生產(chǎn)和理論研究提供數(shù)字依據(jù)和參考。

1材料和方法
1.1實驗材料大豆粉：將生大豆粉碎，過60目標(biāo)準(zhǔn)篩。在85 ℃和140 ℃下分別處理0、45、90、135和180min冷卻后裝入封口袋保存?zhèn)溆谩?/font>
1.2化學(xué)試劑

本實驗所用試劑均為分析純(AR)，實驗用水為蒸餾水。

1.3測定方法
1.3.1pH增值法

實驗原理：將研細(xì)的試樣與尿素緩沖液混合，尿素在尿素酶作用下水解產(chǎn)生氨，使溶液pH 值改變，改變的程度與脲酶活性大小相關(guān)，因此可以用其與空白溶液的差值表示脲酶活性高低，單位為△pH 值。

1.3.1.1主要溶液配制（1）磷酸緩沖液：將3.403 g磷酸氫二鉀加入100 ml水中溶解；將4.335 g磷酸氫二鉀溶于100 ml水中；將兩種溶液混合，稀釋至1000 ml。用弱酸或弱堿調(diào)至pH =7.0。
（2）尿素緩沖液：將15 g尿素加入500 ml上述磷酸緩沖液中。用弱酸或弱堿調(diào)至pH =7.0。
1.3.1.2操作方法取0.200 g試樣，裝入比色管中。加入10 ml尿素緩沖液，迅速蓋上蓋子，劇烈搖動。將比色管置于30±0.5 ℃的恒溫水浴鍋中，準(zhǔn)確保持30 min。
另稱取等量試樣放入另一支比色管中，加入10 ml磷酸緩沖液，蓋上蓋子，將試樣與緩沖液混合均勻，置于水浴鍋中保持30 min，作為空白試驗。
每隔5 min將水浴鍋中比色管中的試樣搖勻一次。
每個比色管保持30 min后，從水浴鍋中取出，倒出上清液于小燒杯中。并在從水浴鍋中取出恰好5 min時，用酸度計測出pH值。
1.3.1.3
計算公式UA= pH 1－pH 0
式中：UA——脲酶活性，△pH；
pH 1——樣品使尿素分解后的樣液pH值；
pH 0——空白樣液的pH值.

1.3.2滴定法

原理：樣品與中性尿素緩沖液混合，在( 30±0.5) ℃下保持30 min, 樣品中脲酶催化尿素水解產(chǎn)生氨，用過量的鹽酸中和氨，再用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液回滴到溶液pH 值為4.70。脲酶活性用每克樣品在30±0.5 ℃下每分鐘產(chǎn)生氨態(tài)氮的毫克數(shù)表示，單位為NH3 mg/ g·min。

1.3.2.1
溶液配制（1）尿素緩沖液：將8.95 g磷酸氫二鈉和3.40 g磷酸二氫鈉溶于水中，并稀釋至1000 ml，再將30 g尿素溶于此磷酸緩沖液中。
（2）0.1 mol/L鹽酸溶液：8.3 ml鹽酸注入1000 ml水中。
（3）0.1 mol/L氫氧化鈉溶液：稱取4 g氫氧化鈉溶于水中，并稀釋至1000 ml。
1.3.2.2
操作方法（1）氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)定
稱取0.6 g于105~110 ℃烘至恒重的基準(zhǔn)鄰苯二甲酸氫鉀，準(zhǔn)確至0.0001 g，溶于50 ml水中，加2滴酚酞指示劑，用配制好的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液呈粉紅色。
同時做空白試驗。
（2）UA的測定
稱取0.2000 g試樣，轉(zhuǎn)入比色管中，加入10 ml尿素緩沖液，立即蓋好蓋子并劇烈搖動。置于30±0.5℃恒溫水浴上準(zhǔn)確保持30 min后立即加入10 ml 0.1 mol/L鹽酸，迅速冷卻到20℃，將比色管內(nèi)容物全部轉(zhuǎn)入燒杯，用水沖洗比色管2~3次，立即用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定至pH＝4.7。
另取比色管做空白試驗，加入10 ml尿素緩沖液，10 ml 0.1 mol/L鹽酸。稱取與上述試樣量相當(dāng)?shù)脑嚇樱杆偌尤氡壬苤校⒓瓷w好比色管并劇烈搖動，在30±0.5℃恒溫水浴上準(zhǔn)確保持30 min，冷卻到20℃，將比色管內(nèi)容物全部轉(zhuǎn)入燒杯，用水沖洗比色管2~3次，用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定至pH＝4.7。
1.3.2.3
計算公式

U=14×c(V0 - V)/30×m

式中: U—— —每分鐘每克大豆制品釋放氮的毫克量表示的脲酶活性；

c —— —氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度(mol/l) ；

V0 —— —空白試驗消耗的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液體積(ml)；

V—— —測定試樣消耗的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液體積(ml) ；

m—— —試樣質(zhì)量( g).

1.3.3蛋白質(zhì)溶解度的測定

原理：氫氧化鉀蛋白質(zhì)溶解度可以反映大豆粕產(chǎn)品加熱過度的情況，不同加熱程度的大豆粕，氫氧化鉀蛋白質(zhì)溶解度不同。先測定大豆粕樣品在規(guī)定的條件下，可溶于氫氧化鉀溶液中的粗蛋白質(zhì)含量，再測定同一大豆粕樣品中總的粗蛋白質(zhì)含量，計算出氫氧化鉀蛋白質(zhì)溶解度[9-11]。

1.3.3.1
操作方法稱取樣品1.5 g，置于250 ml燒杯中，用移液管移取75 ml
氫氧化鉀溶液，用磁力攪拌器攪拌20 min，再將攪拌好的溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，以2700 r·pm
離心10 min，用移液管移取濾液15 ml,放入消化管中，用凱氏定氮法測定蛋白含量。
另稱取0.3 g樣品，按照凱氏半微量定氮法測定原料樣品中的粗蛋白含量。
1.3.3.2
計算公式蛋白質(zhì)溶解度＝15 ml上清液中粗蛋白質(zhì)的質(zhì)量(g)/ 0.3 g試樣中粗蛋白質(zhì)的質(zhì)量(g)

2結(jié)果與分析
2.1 85℃下不同加工時間段大豆粉脲酶活性及蛋白質(zhì)溶解度85℃下大豆粉脲酶活性及蛋白質(zhì)溶解度結(jié)果見表1。由表可見， 85℃加熱0-180min的條件下，大豆粉脲酶活性及蛋白質(zhì)溶解度變化不明顯。結(jié)果表明85℃下熱處理對大豆蛋白破壞作用不明顯，該溫度大豆粉中的蛋白酶抑制劑的活性不足以破壞。滴定法和增值法測得的脲酶活性大小，在數(shù)值上差異較小。

表1
85℃下大豆粉脈酶活性及蛋白質(zhì)溶解度

Tab.1 The result of urease activit and protein solubility of soybean meal under 85℃

加熱時間 min	脲酶活性		蛋白質(zhì)溶解度（%）
加熱時間 min	pH增值法UA（△pH）	滴定法UA (NH3 mg/g·min)	蛋白質(zhì)溶解度（%）
0	2.30	2.47	82.11
45	2.22	2.43	81.05
90	2.16	2.40	80.07
135	2.08	2.38	76.84
180	2.00	2.35	75.03

2.2 140℃下不同加工時間段大豆粉脲酶活性及蛋白質(zhì)溶解度

由表可見， 140℃加熱條件下，大豆粉脲酶活性及蛋白質(zhì)溶解度隨加熱時間延長降低，135min時，pH增值法測定的脲酶活性為0；蛋白質(zhì)溶解度從82.1%降至22.5%。表明140℃熱處理對大豆蛋白和脲酶活性破壞明顯，說明140℃熱處理可以破壞大豆粉中蛋白酶抑制劑活性，但對蛋白質(zhì)品質(zhì)也有不良影響。兩種方法測得的脈酶活性大小，與85℃熱處理一樣，在數(shù)值上滴定法稍大，但與增值法無明顯區(qū)別。

表2. 140℃下大豆粉脈酶活性及蛋白質(zhì)溶解度

Tab.2 The result of urease activit and protein solubility of soybean meal under 140℃

加熱時間 min	脲酶活性		蛋白質(zhì)溶解度（%）
加熱時間 min	pH增值法UA（△pH）	滴定法UA (NH3 mg/g·min)	蛋白質(zhì)溶解度（%）
0	2.30	2.47	82.1
45	0.15	0.20	72.5
90	0.04	0.05	53.8
135	0.00	0.02	33.7
180	0.00	0.00	24.3

3討論
3.1兩種方法對脲酶活性測定結(jié)果的比較從本實驗結(jié)果表明，雖然不同方法測定同一樣品的結(jié)果在數(shù)值上不完全等，但兩種方法所測得脲酶活性的強(qiáng)弱趨勢相一致。根據(jù)國家在制定大豆餅粕脲酶活性的測定方法(滴定法)時，并規(guī)定了大豆餅粕脲酶活性用此方法測得的數(shù)值不應(yīng)大于0.4 NH3mg/g·min[7，12]。從表1和表2結(jié)果可見，在85℃條件下，作用0~180 min內(nèi)，大豆粉的脲酶活性均未能達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明，在該條件下產(chǎn)品所含胰蛋白酶抑制因子的被破壞程度較低，并對大豆粉蛋白的質(zhì)量影響不大。相對而言，在140℃下，作用0~180min內(nèi)，大豆粉的脲酶活性已大大降低，均達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)，尤其是當(dāng)作用時間超過135 min后，兩種方法測定的結(jié)果顯示被測樣品中脲酶活性為0。
3.2脲酶活性與蛋白質(zhì)溶解度的關(guān)系除了脲酶活性外，蛋白質(zhì)溶解度是近年來判定大豆制品質(zhì)量的常用指標(biāo)。由于脲酶活性高低反映大豆餅粕受熱程度，可間接反映蛋白酶抑制因子活性高低，但當(dāng)脲酶活性為0后，進(jìn)一步加熱，脲酶活性仍為0，即此時脲酶活性不再能反映大豆餅粕的受熱程度，而蛋白質(zhì)溶解度仍可隨受熱程度的增加進(jìn)一步降低[13]，因此，脲酶活性主要用于評價大豆制品是否過生，在反映大豆及其制品的加工是否受熱過度方面，用蛋白質(zhì)溶解度來評判更為適宜[7]。

20世紀(jì)60年代末，Rinehart首先采用0.2%氫氧化鉀測蛋白質(zhì)溶解度的方法來評定大豆粕加工的適宜程度，由于該方法簡單、易學(xué)，重復(fù)性和再現(xiàn)性好，被世界各國廣泛采用[14]。Araba和Dale研究結(jié)果表明，當(dāng)大豆粕的蛋白質(zhì)溶解度低于70%時，很可能影響其營養(yǎng)價值，而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶解度低于65%時，則肯定大豆粕已加熱過度[15-16]。近年來，隨著加工技術(shù)的不斷改進(jìn)和完善，完全可以生產(chǎn)出蛋白質(zhì)溶解度超過85%甚至達(dá)到90%，而脲酶活性接近于零的優(yōu)質(zhì)大豆產(chǎn)品[11]。

從表1和2結(jié)果顯示，大豆粉的蛋白質(zhì)溶解度隨著加工溫度的提高和作用時間的延長而下降。在140℃下，隨著作用時間的延長，大豆粉蛋白質(zhì)溶解度降低更加顯著。同時，兩種方法的測定結(jié)果在數(shù)值上不能相互替代，由此可見，在對大豆餅粕脲酶活性進(jìn)行表述或提出具體限量要求時，應(yīng)明確測定方法，避免引起不必要的糾紛。對于鑒定豆粕質(zhì)量時，脲酶活性只能判定其內(nèi)非營養(yǎng)成分的鈍化程度，而對過度加熱的豆粕蛋白變性程度卻無法測定，故建議用脲酶活性與蛋白質(zhì)溶解度相結(jié)合的檢測手段進(jìn)行評價。

作者: xishanzhongke 時間: 2009-7-27 10:54
詳細(xì)樓主的資料，收藏了！

作者: weihua0608 時間: 2009-8-2 17:09
怎么沒看到苯酚紅這三個字呢?

作者: LXSLDXH0521 時間: 2009-8-2 22:40
我們沒有離心機(jī), 測不了氫氧化鉀溶解度

作者: zhenjieli 時間: 2012-6-1 12:01
看后不能光說感謝就行了，分享我的的體會：
1、該方法測脲酶活性比較簡單，大部分企業(yè)都能做的，而且相對較準(zhǔn)；
2、脲酶活性反映胰蛋白酶抗?fàn)I養(yǎng)因子的多少和大豆加工的生熟程度以及蛋白溶解度——主要是這三點。
3、一般加熱過度的豆粕脲酶活性會高，蛋白溶解度會低于65%。較好的豆粕、大豆溶解度胃80左右。

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