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畜牧人

標題: 飼料中沙門氏菌的檢測方法 [打印本頁]

作者: 蘇明 時間: 2010-1-7 14:49
標題: 飼料中沙門氏菌的檢測方法
求助：飼料中沙門氏菌的檢測方法（最好有WORD電子版），謝謝

作者: liyan123456 時間: 2010-1-7 16:07
沙門氏菌檢測方法研究進展
　畜禽飼用含有沙門氏菌的飼料，如果菌量達到一定數目，就可引起疾病或帶菌，因此準確、快速地檢測飼料中的沙門氏菌，對于防止畜禽和人類沙門氏菌污染具有十分重要的意義。傳統沙門氏菌檢測方法，由于其檢測周期長、漏檢率高、程序復雜、所需試劑繁多等缺點已遠遠不能滿足現代檢測要求。隨著現代科學技術的不斷發展，特別是免疫學、生物化學、分子生物學的不斷發展，人們已創建了不少快速、簡便、特異、敏感、低耗且適用的沙門氏菌檢測方法。
　　1  對傳統的沙門氏菌檢測方法的改進
　　由于檢測沙門氏菌的傳統培養基選擇性和特異性不能達到今人滿意的效果，沙門氏菌在飼料中的檢出率又較低，而檸檬酸菌屬、變形桿菌等均可能對沙門氏菌的檢測產生干擾，因此傳統的沙門氏菌檢測方法需不斷改進，其改進內容主要集中在選擇性培養基的選擇上。如由于沙門氏菌具有可特異性地分解丙烯乙二醇產酸，使中性紅指示劑變紅的生化特征，在分離培養基中加入丙烯乙二醇、5一溴一4-氯-3一吲哚一β-D呋喃半乳糖，可實現對沙門氏菌的分離與鑒定工作同步進行，使沙門氏菌檢測所需時間從常規方法的 4～6 d縮短至2 d；采用Salmosyst培養基進行增菌后，在Rambach培養基上進行分離培養，可及用對沙門氏菌的快速檢測，大大減少了檢測中所需培養基種類，同時培養過程全部在37℃下進行，操作簡便；采用Salmosyst增菌液，對熱傷害沙門氏菌環恢復效果，比常規檢測方法中采用緩沖蛋白胨水和四硫磺酸鹽煌綠增菌液更好，使檢測靈敏度得到較大的提高。
　　2  快速酶觸反應及代謝產物的檢測
　　快速酶觸反應是根據細菌在其生長繁殖過程中可合成和釋放某些特異性的酶，按酶的特性，選用相應的底物和指示劑，將它們配制在相關的培養基中。根據細菌反應后出現的明顯的顏色變化，確定待分離的可疑菌株，反應的測定結果有助于細菌的快速診斷。這種技術將傳統的細菌分離與生化反應有機的結合起來，并使得檢測結果直觀，成為今后微生物檢測發展的一個重要發展方向。據Manafi等報道，沙門氏菌屬（包括各亞屬）均產生辛酯酶，這一性能是腸桿菌科除沙雷氏菌屬外其它各屬細菌所不具備的，因此可用來鑒別沙門氏菌與腸桿菌科其它屬細菌。近來，Aguirre,Ruiz,Manafi，Freydiere等用意大利Biolife公司的試劑“MUCAP Test”測試腸桿菌科細菌、假單胞菌屬、氣單胞菌屬和類志賀氏鄰單胞菌，證明該法對沙門氏菌有很高的敏感性和特異性，操作也十分簡便、快速。中華人民共和國進出口商品檢驗行業標準SN 0332－94即為用4-甲基傘形酮辛酯（MUCAP）試劑對沙門氏菌進行檢驗的方法。
　　3  免疫學方法檢測沙門氏菌抗原或抗體的技術
　　3．l  抗血清凝集技術
　　早在1933年，Lancefield就成功地用多價血清對鏈球菌進行了血清分型。隨著抗體制備技術的進一步完善，尤其是單克隆抗體的制備，明顯提高了細菌凝集實驗的特異性，可用于沙門氏菌的分型和鑒定，如以沙門氏菌屬特異單抗HRP標記抗體為核心試劑直接ELISA試驗，為沙門氏菌檢驗和診斷提供了新技術。揚州大學研制兩株針對沙門氏菌屬共同表位的單抗 CBS和 de7它們與 99％的沙門氏菌屬內不同血清的沙門氏菌反應，在此基礎上，建立了直接的ELISA方法，并構建了沙門氏菌快速檢測試劑盒。
　　3．2  乳膠凝集實驗
　　將特異性的抗體包被在乳膠顆粒上，通過抗體與相應的細菌抗原結合，產生肉眼可見的凝集反應。通常此法需獲得細菌純培育物，再將培養物與致敏乳膠反應。目前FDA認可的產品有Bactigen、Spectate、Microscreen、  Serobact等，見表 l。
　　3．3  熒光抗體檢測技術
　　用于快速檢測細菌的熒光抗體技術主要有直接法和間接法。直接法是在檢測樣品上直接滴加已知特異性熒光標記的抗血清，經洗滌后在熒光顯微鏡下觀察結果。間接法是在檢樣上滴加已知的細菌特異性抗體，等作用后經洗滌，再加入熒光標記的第二抗體。如研制成的抗沙門氏菌熒光抗體，用于750份食品樣品的檢測，結果表明，與常規培養法符合率基本一致
　　3．4  酶聯免疫測試技術
　　酶聯免疫技術應用，大大提高了檢測的敏感性和特異性，現已廣泛地應用在沙門氏菌的檢驗，如Salmonella－TEK、 TECRA、 BacTrce、 Assurance、EQUATE等，見表1。應用酶聯免疫技術制造的mini-Vidas全自動免疫分析儀，是用熒光分析技術通過固相吸附器，用已知抗體來捕捉目標生物體，然后以帶熒光的酶聯抗體再次結合，經充分沖洗，通過激發光源檢測，即能自動讀出發光的陽性標本，其優點是檢測靈敏度高，速度快，可以在48 h的時間內快速鑒定沙門氏菌。
　　4  聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）技術
　　PCR技術原理為提高DNA探針的敏感性，可先將靶 DNA序列擴增，增加 DNA數量，使其達到足夠的檢測量，若反應以動力學為基礎，則能定量分析。1983年 Millus和 Cetus發明了最基本的擴增 DNA或增加樣品中特殊核苷酸片段數量的方法-聚合酶鏈反應即PCR法。PCR法建立在三步重復發生反應的基礎上。①通過熱處理將雙股DNA變性裂解成單股DNA；②退火延伸引物至特異性寡核苷酸上；③酶促延伸引物與DNA配對合成樓板，引物退火，變性DNA片段，引物雜交形成的模板可參與再次反應。溶液中核苷酸通過酶聚合成相互補對的DNA片段，并能重新裂解成單股DNA成為下次PCR復制的模板。因此每次循環特異性DNA將以雙倍量增加。典型擴增經過20～40次循環能引起100萬倍的擴增。在PCR反應中引人Taq聚合酶使反應得以半自動化和簡便反應程序。用擴增DNA進行的PCR反應具有無與倫比的優越性。
　　由于沙門氏菌血清型特別繁多（目前世界上已分離出近2 000多個血清型，我國也已發現了近百個血清型），因此，對沙門氏菌的檢測往往不能準確和靈敏，而 Xiaoming Li（2000），CAROLA  BURTSCHER（1999）， Kapley A．（2000）等利用 PCR技術卻能準確地檢測出微量的沙門氏菌。
　　5  核酸探針（Nuclear acid Probe）的應用
　　5．l  核酸探針
　　將已知核苷酸序列DNA片段用同位素或其他方法標記，加入已變性的被檢DNA樣品中，在一定條件下即可與該樣品中有同源序列的DNA區段形成雜交雙鏈，從而達到鑒定樣品中DNA的目的，這種能認識到特異性核苷酸序列有標記的單鏈DNA分子核酸探針或基因探針。
　　5．2核酸探針的類型
　　根據核酸探針中核苷酸成分的不同，可將其分成DNA探針或RNA探針，一般大多選用DNA探針；根據選用基因的不同分成兩種，一種探針能向微生物中全部DNA分子中的一部分發生反應，它對某些菌屬、菌種、菌株有特異性，另一種探針只能限制性同微生物中某一基因組DNA發生雜交反應，如編碼致病性的基因組，它對某種微生物中的一種菌株或僅對微生物中某一菌屬有特異性。這類探針檢測的基因相當保守，包括大部分rRNA，因為它既可能在一種微生物中出現，又可代表一群微生物。
　　5．3  探針檢測技術中存在的問題
　　檢測一種菌就需要制備一種探針，目前尚未建立所有致病菌的探針，盡管檢測速度快，但要達到檢測量還要對樣品進行一定時間的培養，任何一種方法不可能有 100％的特異性和敏感性，所以必須考慮假陽性和假陰性的問題。
　　沙門氏菌污染量小，常受應激損傷，不易恢復，現用檢測方法得到陰性報告最少需4d陽性報告還要延遲2～3d。研究檢測沙門氏菌的探針難度大，因為它擁有2 000多個血清型， Fillal等人從染色體序列和構建的質粒文庫中分離到一個適用于沙門氏菌檢測的探針。它能和沙門氏菌而不和其他微生物及樣品培養基發生非特異性反應。這種用同位素標記的探針，能識別350株不同的沙門氏菌。由于該方法最小檢出量只有 1個細菌／25 g樣品，所以需要增菌培養。
　　AOAC最近認可了Gene－Trak沙門氏菌比色分析法，見表1。這種探針標記物為異硫氰酸熒光素（FITC），再用辣根過氧化酶標記抗FITC的抗體結合放大探針，在多聚腺苷酸尾部和多聚胸腺嘧啶侵染棒固相薄膜上雜交，對239株沙門氏菌的特異性檢出率為 100％，假陽性率為 0．8％。
表1  美國FDA認可使用的沙門氏菌檢測系統和試劑盒
類別             商品名稱       分析手段
沙門氏菌    Automicrobic,GNI    生化試驗

自動檢測系統
核酸雜交分析    GENE-TRAK          同位素
            GENE-TRAK          比色法

免疫分析       Bactigen          LA
            Spectate          LA
            Microscreen          LA
            Wellcolex          LA
            Serobact          LA
                                 LA
            1-2 Test    Immuno-Diffusion
            PATH-STIK       Dipstick-EIA
         Salmonella-TEK       EIA
               TECRA             EIA
               Unique       Dipstick-EIA
         Salmonella-TEK       EIA
               TECRA             EIA
               Unique       Dipstick-EIA
               EQUATE             EIA
            BacTrace          EIA
            Assurance          EIA
            Isogrid             HGMF
其它商品化       OSRT          Medium/motility
快速檢測方法 Rambach             Medium
和培養基       MUCAP          C8,Esterase
            XLT-4             Medium

　　注：EIA，酶免疫分析；LA，乳膠凝集；HGMF疏水格柵濾膜；MUCAP，4-甲基傘形酮酮辛酯（4-Methylumbelifefylcaprylate）。
　　6  沙門氏菌檢測儀器及自動化系統
　　近年來，隨著計算機技術的不斷發展，對病原微生物的鑒定技術朝著微量化、系列化、自動化的方向發展，從而開辟了微生物檢測與鑒定的新領域。最有代表性的是AMS微生物自動分析系統，見表1。
　　AMS為美國VITEK廠產品，屬于自動化程度高的儀器，由7個部件組成應用一系列小的多孔的聚苯乙烯卡片進行測試，卡片含有干燥的抗菌藥物和生化基質，可用于不同的用途，卡片用后可棄去。
　　操作時，先制備一定濃度的欲鑒定菌株的菌懸液，然后將菌懸液接種到各種細菌的小卡上，將其放入具有讀數功能的孵箱內，每隔一定時間，儀器會自動檢測培養基的發酵情況，并換算成能被計算機所接受的生物編碼。最后由計算機判定，打印出鑒定結果。
　　該套系統檢測卡片為14種，每一種鑒定卡片要含有25種以上的生化反應指標，基本同常規檢測鑒定，檢測所需時間最長不超過 20 h。
　　7  其它沙門氏菌檢測方法
　　ISO－GRID檢測系統（表1）是一種基于疏水性網膜（HGMF）的過濾系統。該系統通過使用這種含有1600個小方格的濾膜，來對微生物進行檢測或計數。
　　首先，稀釋的樣品通過5 um的不銹鋼預過濾器過濾，過濾掉可能引起微生物分析誤差的樣品殘渣顆粒。
　　然后，樣品通過流水的濾膜過濾。再將濾膜放在特異性的瓊脂培養板上培養，以檢測目標微生物。培養完成后，在膜上檢測目標微生物，并記錄陽性區域的數量。
　　濾膜不會染上瓊脂培養基的顏色，從而很容易地區別微生物，并進行鑒別和記數。此方法快速簡便，重復性好，而且，除沙門氏菌外，還適用于大腸桿菌O157﹕H7、酵母、霉菌、大腸菌群及大腸桿菌的檢測和計數。

歡迎光臨畜牧人 (http://www.ylikhb.com/)

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