摘 要
采用胰蛋白酶來(lái)模擬水產(chǎn)動(dòng)物消化酶，在胰蛋白酶的基礎(chǔ)上添加復(fù)合酶，以探討在水產(chǎn)料中添加復(fù)合酶的效果。結(jié)果顯示：復(fù)合酶A對(duì)鯉魚料的消化率很低，僅為3.72%，胰蛋白酶的基礎(chǔ)上添加復(fù)合酶A，鯉魚料的干物質(zhì)消化率從11.55%提高到25.46%；復(fù)合酶B對(duì)飼料樣品的消化率為2.82%，在胰蛋白酶的基礎(chǔ)上添加酶B，鯉魚料的消化率并沒有提高。這次表明在本實(shí)驗(yàn)條件下，以非淀粉多糖酶為主要酶類的復(fù)合酶A可有效破壞降解植物原料的細(xì)胞壁，促進(jìn)消化酶對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化，而復(fù)合酶B活性可能很低，對(duì)飼料消化率沒有改善作用，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè)，對(duì)以植物原料為主的理科魚類，復(fù)合酶A可能比復(fù)合酶B更合適。
關(guān)鍵詞
離體消化法；水產(chǎn)復(fù)合酶；消化率
外源酶制劑可彌補(bǔ)內(nèi)源酶分泌的不足，也可以提供某些動(dòng)物體不能分泌的酶類，從而促進(jìn)動(dòng)物對(duì)飼料的消化消化利用，目前在畜禽料中已廣泛應(yīng)用。水產(chǎn)用酶制劑也日漸興起，但問題突出，譬如多數(shù)水產(chǎn)復(fù)合酶制劑并非針對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物開發(fā)的，其酶的來(lái)源與酶活檢測(cè)均以畜禽為參照等；實(shí)際上，畜禽和水產(chǎn)動(dòng)物的消化生理差異顯著，不能僅憑酶活測(cè)定結(jié)果或廠家宣傳就在水產(chǎn)飼料中推廣應(yīng)用，而需對(duì)水產(chǎn)酶制劑在水產(chǎn)飼料中應(yīng)用的可行性進(jìn)行評(píng)估。養(yǎng)殖試驗(yàn)是最好的評(píng)估方法，但該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，采用離體消化試驗(yàn)，將會(huì)節(jié)約大量的時(shí)間和精力。
本試驗(yàn)旨在于探討離體消化法篩選水產(chǎn)酶制劑的可行性。采用模擬無(wú)胃魚消化環(huán)境(溫度、腸道pH值等)，采用一步消化法，用水產(chǎn)酶制劑消化鯉魚料，測(cè)定其消化率，為酶制劑篩選提供參考。
1材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
1.1.1水產(chǎn)復(fù)合酶
本次試驗(yàn)選用兩種水產(chǎn)酶制劑(酶A和酶B)，主要酶活見表1。
1.1.2胰蛋白酶
Trypsin 1：250酶活力：1000～1500U/mg(上海源聚生物科技有限公司)
1.1.3飼料來(lái)源
為市場(chǎng)購(gòu)買某公司鯉魚料，樣品均通過105℃烘干處理，粉碎過80目篩保存?zhèn)溆谩?/p>
表1
復(fù)合酶A和復(fù)合酶B主要酶酶活
| 酶A | 酶B | ||
| 有效成分種類 | 含量(U/g) | 有效成分種類 | 含量(U/g) |
| 果膠酶 | 55000 | 淀粉酶 | 20000 |
| 甘露聚糖酶 | 5000 | 蛋白酶 | 11000 |
| 中性蛋白酶 | 2800 | 果膠酶 | 900 |
| 纖維素酶 | 2500 | 纖維素酶 | 100 |
| 酸性蛋白酶 | 2200 | 脂肪酶 | 70 |
| 木聚糖酶 | 2000 | ||
| Α-半乳糖苷酶 | 1400 | ||
| Β-葡聚糖酶 | 1000 | ||
| 淀粉酶 | 380 | ||
1.1.4
試驗(yàn)器械及藥品
10mL移液管、250mL帶塞三角瓶、恒溫水浴搖床、烘箱、凱氏定氮儀、冰箱和電子分析天平(感量0.00001g)、試驗(yàn)用樣品粉碎機(jī)、金屬篩(孔徑80目)、電爐、消化爐、電熱式恒溫烘箱、干燥器、過濾裝置、磁力攪拌器、離心機(jī)。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1
磷酸緩沖溶液制備
精確稱取分子量為358.0的磷酸氫二鈉固體結(jié)晶115.992g和分子量為156.01的磷酸二氫鈉11.8568g
于2000mL燒杯中，加入少許去離子水將其溶解，并定容至2000mL，最后用酸度計(jì)將pH值調(diào)至7.4，保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2
酶液制備
水產(chǎn)復(fù)合酶酶液制備：稱取5g復(fù)合酶制劑于500mL 0.2M pH為7.4的磷酸緩沖溶液中，攪拌30min后靜置沉淀并過濾，所得標(biāo)準(zhǔn)復(fù)合酶酶液為0.01g/mL，保存?zhèn)溆谩?/p>
胰蛋白酶酶液制備:精確稱取胰蛋白酶2.5g于100mL 0.2M pH為7.4的磷酸緩沖溶液中，所得標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶酶液為0.025g/mL，保存?zhèn)溆谩Ｓ捎跊]有勻漿機(jī)和冷凍離心機(jī)，用胰蛋白酶模擬魚腸道消化酶。
1.2.3
試驗(yàn)設(shè)計(jì)
本試驗(yàn)采用胰蛋白酶來(lái)替代水產(chǎn)動(dòng)物消化酶，具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。
1.2.4
離體消化步驟
A、精確稱量飼料樣品1g(精確到0.0001g)于250mL帶塞三角瓶中，添加0.2mol/L pH7.4的磷酸緩沖液100mL ，并按試驗(yàn)設(shè)計(jì)添加酶液。
B、28±0.1℃水浴鍋中保溫進(jìn)行酶水解12h，搖床以 100rpm 振搖進(jìn)行酶解
C、將酶水解好的飼料樣品過濾瓶(定量濾紙+稱量瓶先在103℃下烘干1h，冷卻器中冷卻恒半小時(shí)重后稱重記錄)。將濾渣+定量濾紙+稱量一起在103℃下烘干，恒重后稱重并記錄。
表2
試驗(yàn)設(shè)計(jì)
| 處理組 | 1（對(duì)照） | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 0.2M pH7.4磷酸緩沖溶液(mL) | 120 | 110 | 100 | 110 | 100 | 110 |
| 樣品消化添加量(g) | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 |
| 復(fù)合酶A(mL) | ∕ | 10 | 10 | ∕ | ∕ | ∕ |
| 復(fù)合酶B(mL) | ∕ | ∕ | ∕ | 10 | 10 | ∕ |
| 胰蛋白酶(mL) | ∕ | ∕ | 10 | ∕ | 10 | 10 |
1.2.5數(shù)據(jù)處理
本試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)處理均采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行方差分析和多重比較。
2
結(jié)果與討論
結(jié)果見表3。
從消化數(shù)據(jù)上看出，空白處理組的干物質(zhì)離體消化率為31.48%,由于空白對(duì)照組無(wú)添加任何消化酶，可離體酶解實(shí)驗(yàn)的干物質(zhì)消化率達(dá)到31.48%，再結(jié)合考慮飼料樣品中水溶性物質(zhì)應(yīng)占的比例，出現(xiàn)這種原因的可能是所用飼料樣品在稱量的過程中發(fā)生吸濕現(xiàn)象，整體含水量偏大，所以造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)整體偏大，但對(duì)處理組間的相對(duì)比較和分析無(wú)太大影響。
從表3可以看出，處理3樣品飼料干物質(zhì)離體消化率最大，顯著大于處理1、處理2、處理4、處理5和處理組6(P＜0.05)；其次處理5和處理6干物質(zhì)消化率顯著大于處理1，其余各組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
表3
干物質(zhì)離體消化率
| 處理號(hào) | 酶制劑 | 樣品消化前后失重（％） | 消化率（％） |
| 1 | 空白對(duì)照 | 31.48±1.22a | .00±.00 a |
| 2 | 復(fù)合酶A | 35.20±3.40a | 3.72±4.61 ab |
| 3 | 復(fù)合酶A+胰蛋白酶 | 56.94±4.64c | 25.46±3.42 c |
| 4 | 復(fù)合酶B | 34.30±3.89a | 2.82±5.11 ab |
| 5 | 復(fù)合酶B+胰蛋白酶 | 42.65±1.34b | 11.17±2.55 b |
| 6 | 胰蛋白酶 | 43.03±1.65b | 11.55±2.86 b |
注：同一列內(nèi)處理間標(biāo)注字母全部不同表示達(dá)0.05的顯著水平標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)字母標(biāo)識(shí)表示各組間無(wú)顯著性差異。
由此可見，復(fù)合酶A對(duì)鯉魚料的消化率很低，僅為3.72%，和對(duì)照組相比消化率沒有得到顯著性提高；但在胰蛋白酶的基礎(chǔ)上添加復(fù)合酶A，鯉魚料的干物質(zhì)消化率從11.55%提高到25.46%。這一結(jié)果表明，以非淀粉多糖酶為主要酶類的復(fù)合酶A，由于其中的蛋白酶和淀粉酶等酶類含量較低，單獨(dú)消化飼料時(shí)對(duì)飼料消化率沒有明顯改善作用，但由于其中的非淀粉多糖酶能有效的降解植物原料的細(xì)胞壁，協(xié)助消化酶對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化，大大提高了消化酶對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化。本試驗(yàn)條件是模擬無(wú)胃魚的消化環(huán)境(溫度、pH)，因此根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè)，在無(wú)胃魚的消化道中，復(fù)合酶A可以發(fā)揮較好的活性，能有效破壞降解植物原料的細(xì)胞壁，促進(jìn)內(nèi)源消化酶對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化，從而提高飼料消化率。
表4
酶B酶活檢測(cè)條件
| 酶種類 | 檢測(cè)溫度（℃） | 檢測(cè)pH |
| 蛋白酶 | 37 | 3.0 |
| 淀粉酶 | 40 | 4.5 |
| 纖維素酶 | 40 | 4.5 |
| 脂肪酶 | 37 | 7.0 |
| 果膠酶 | 40 | 3.5 |
酶B對(duì)飼料樣品的消化率只有2.82%，且在胰蛋白酶的基礎(chǔ)上添加復(fù)合酶B，鯉魚料的消化率也沒有得到進(jìn)一步提高。從表1可知，復(fù)合酶B中蛋白酶、淀粉酶等酶活很高，但為何對(duì)鯉魚料的消化率很低呢？從表4可以看出,復(fù)合酶B酶活檢測(cè)的溫度都在37℃以上，除了脂肪酶外，其它幾種酶的檢測(cè)都是pH小于或等于4.5的條件下檢測(cè)的，而本實(shí)驗(yàn)是溫度是28℃，pH為7.4，因此造成復(fù)合酶B對(duì)鯉魚料的消化率低的原因可能是在本實(shí)驗(yàn)條件下復(fù)合酶B活性低。這一試驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè)在無(wú)胃魚的消化道環(huán)境中，酶B的活性很低，不能發(fā)揮作用。
3
小結(jié)
本試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)以植物原料為主的理科魚類，酶A比酶B更合適。
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