上海邦成 發表于 2010-12-9 16:31
抗菌肽在國外已有20多年的歷史了，最早是用在人醫上的。代替抗生素還是很有效果的！！！
抗菌肽與抗生素的體外抗菌效果比較
汪以真,王中強,許梓榮
(浙江大學飼料科學研究所教育部動物分子營養重點實驗室,浙江杭州310029)
摘要:應用由Hancock實驗室改進的微量肉湯稀釋法測定了cecropin P1、cecropin A、magainin 2、defensin 1、bactenecin、lactoferricin和indolicidin等7種抗菌肽和鹽酸金霉素、去甲萬古霉素、土霉素、強力霉素等4種抗生素的體外抗菌活性,并且使用薄層瓊脂糖孔穴擴散法比較了抗菌肽中cecropin P1和cecropin A與土霉素和呋喃唑酮對大腸桿菌K88的抑菌效果。結果發現,抗菌肽與抗生素一樣對幾種革蘭氏陽性菌和陰性菌都有不同程度的抗菌效果。其中cecropin A、cecropin P1和defensin 1對大腸桿菌的2個菌株ATCC25922和K88的抗菌活性高于抗生素,defensin1是各種抗菌肽中對金黃色葡萄球菌抗菌效果最好的。抗生素對試驗用金黃色葡萄球菌的抑制活性總體上要好于抗菌肽。與抗生素相比,cecropin A、cecropin P1和indolicidin對豬霍亂沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌具有更好的抗菌效果。另外,抗菌肽的抑菌圈邊緣十分清晰,而抗生素的整個抑菌圈都比較模糊且界線不明。因此,從抗菌效果方面考慮,抗菌肽可以代替抗生素用于疾病的預防和治療。
關鍵詞:抗菌肽;抗生素;藥敏試驗
近些年來,畜產品中的抗生素藥物殘留問題越來越受到人們的重視,許多國家包括我國已經嚴格限制將抗生素作為保健和促生長劑添加到畜禽飼料中,有的甚至禁止任何抗生素的使用。同時,由于抗生素的亂用與濫用,也造成了許多細菌產生了耐藥菌株,并且其出現的頻率已超過抗生素新藥的開發速度,給疾病的治療帶來了很大的難度。因此,尋找安全高效的抗生素替代品就顯得十分重要。抗菌肽是生物體內存在的一種天然抗菌活性物質,已經從哺乳動物(包括人)及昆蟲、兩棲動物中發現了幾百種抗菌肽,其中有些已經分離提取了出來,并對其結構、抗菌活性等作了許多的研究,發現其抗菌活性高效、廣譜,并且本身無毒、無害[1,2]。天然的抗菌肽主要存在于生物體中的中性粒細胞、舌部、氣管和小腸表面,其自身攜帶有大量的正電荷[2,3]。盡管目前人們對其抗菌機理還沒有完全弄清楚,但比較一致的觀點認為,它們是通過橫跨膜內外的離子通道的形成來達到殺菌作用的,并且這種作用不需要特殊的受體[2~6]。正是由于這種獨特的作用機制,許多人認為其不易產生耐藥性,是一種高效安全的預防、治療疾病的藥物[6]。本試驗通過體外試驗研究,比較了7種抗菌肽和4種臨床使用的抗生素對幾種革蘭氏陽性菌和陰性菌的抑菌效果,旨在為抗菌肽替代抗生素應用于生產提供資料。
1 材料與方法
1.1 主要試劑、藥品及設備 抗菌肽cecropin P1(豬)、ce-cropin A (豬)、magainin 2 (蛙)、defensin 1 HNP-1 (人)、bactenecin(牛)、indolicidin和lactoferricin(牛),購自美國肽公司(American Peptide Company),其氨基酸序列見表1;4種抗生素為鹽酸金霉素(Chlortetracycline hydrochloride)、去甲萬古霉素(Demethylvancomycin)、土霉素(Oxytetracycline)和強力霉素(Doxycycline),購自中國藥品生物制品檢定所;瓊脂粉(純化),購自中國醫藥(集團)上海化學試劑公司;Pep-tone和yeast extract,購自OXOID公司;瓊脂糖(agarose),購自上海生工;牛血清白蛋白(bovine serumal bumin,BSA),購
自杭州四季青生物工程材料有限公司;乙酸(36%),購自中國醫藥(集團)上海化學試劑公司;Mueller-Hinton(MH)肉湯,購自DIFCO公司;96孔平板(平底)和聚丙烯離心管,購自Nunclon公司;Model 550型酶標儀,購自BIO-RAD公司;9cm培養皿及搖床,實驗室自備。
1.2 細菌 大腸桿菌(E.coli)K88、大腸桿菌ATCC(America Type Culture Collection,美國標準菌庫)25922、豬霍亂沙門氏菌(Salmonella chloleraesuis)ATCC 50020、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)ATCC 50013和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 25923,由浙江省衛生防疫中心提供,-20℃暗處保存于20%甘油冷凍管中備用。
1.3 藥敏試驗
1.3.1
微量肉湯稀釋法(broth microdilution method) 該方法是由NCCLS(National Committee for Clinical Laboratory Standards)推薦的在體外對需氧型細菌進行藥敏試驗的方法[7]。由于抗菌肽自身結構的特殊性,該方法中有些地方不適用于對其進行抗菌活性的測定,于是Hancock實驗室對其做了相應的改進[8],已有對比試驗證明改進后的方法更能準確反映抗菌肽的抗菌效果[9]。首先用無菌蒸餾水在聚丙烯離心管中將抗菌肽和抗生素溶解制成1 280 mg/L的儲備液,然后用等量無菌的0.02%乙酸(含0.4% BSA)稀釋,再用0.01%乙酸(含0.2% BSA)溶液對等量稀釋后的溶液再進行一系列的雙倍稀釋,得到質量濃度為640、320、160……1.25 mg/L的系列稀釋液,4℃下保存備用[8]。將待測細菌在滅菌MH肉湯瓊脂平板上過夜培養,挑取菌落接種于滅菌試管中的MH肉湯,37℃180 r/min過夜培養。將培養后的菌液稀釋至2×105~7×105CFU/mL,向無菌的96孔平板中的1~11孔各加入100μL的菌液,12孔不加菌液而加100μL MH肉湯。然后從1~10孔逐一加入相應的待測抗菌肽,11孔作為掃描對照孔不加肽,37℃90 r/min培養18~24 h,這樣待測抗菌肽的終質量濃度分別為64、32、16……0.125 mg/L。最小抑菌濃度MIC(minimal inhibitoryconcentration)就是能阻止50%以上細菌生長的最小肽濃度[8]。用酶標儀在490 nm下對平板進行掃描,肽的MIC的確定按照比對照孔(11孔)的渾濁程度低50%以上的最小質量濃度計算。從沒有細菌生長的平板孔中的內容物中取10μL涂布到MH瓊脂平板上,37℃培養18 h,以此來確定肽的最小殺菌濃度( MBC )。MBC ( minimal bactericidal concentration)就是能抑制任何殘余菌落生長的肽的最低濃度[8]。
1.3.2
薄層瓊脂糖孔穴擴散法 在7 mL LB+agarose培養基中,加入培養至對數生長期的E.coliK88(107CFU/mL)10μL,搖勻,倒入培養皿,待其冷卻凝固后,用打孔器在培養基上等距離打5個孔(直徑3 mm),標號1、2、3、4、5。第1組分別加入同質量濃度的cecropin A(200、100 mg/L)和cecropinP1到1、2孔和3、4孔中,5號孔加5μL 0.01% HAC作為對照。第2組分別加入同濃度的土霉素、呋喃唑酮、cecropin P1和cecropin A,5孔號加5μL 0.01% HAC作為對照。各組均做3個重復,37℃倒置過夜培養。
2 結果
2.1 微量肉湯稀釋法 見表2。結果表明,抗菌肽與抗生素一樣對幾種革蘭氏陽性菌和陰性菌都有較好的抗菌效果。與抗生素相比,抗菌肽對大腸桿菌的2個不同菌株的抗菌活性更高,其中cecropin A、cecropin P1及defensin 1的活性最高,尤其cecropin A和defensin 1的MIC值只有0.25 mg/L,遠低于4種抗生素的MIC。這一方面說明2類抗菌劑對體內主要的有害菌都有很好的作用效果,另一方面說明總體上抗菌肽的敏感性高于抗生素,殺菌效果更好。另外,cecropin A、cecropin P1和indolicidin對豬霍亂沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的抗菌效果也要好于抗生素,并且它們對前者的活性要更高。土霉素、鹽酸金霉素和強力霉素是動物生產上比較常用的幾種抗生素,從表2可以看出,這3種抗生素對幾種試驗菌株都有較好的抗菌活性,對金黃色葡萄球菌的抗菌效果要好于抗菌肽。去甲萬古霉素對各試驗菌株的活性都比較低,是所有試驗抗菌劑中效果最差的。各試驗菌株對抗菌肽中的cecropinA和P1都比較敏感。Indolicidin在幾種抗菌肽中對金黃色葡萄球菌的效果最好,bactenecin的活性相對較低。
2.2 薄層瓊脂糖孔穴擴散法 幾種抗菌劑的殺菌效果見圖1、2。抗菌肽的抑菌圈邊緣十分清晰,整個抑菌圈呈現明亮狀態,表示所到之處細菌的生長被完全抑制,而抗生素的抑菌圈比較模糊,界線也不是很分明。這說明抗菌肽的抑菌效果比抗生素更徹底。通過對抑菌圈大小比較也進一步驗證了大腸桿菌對抗菌肽更敏感,更容易被其所抑制。
3 討論
1949年Cyanamid公司科研人員發現金霉素有促生長的作用,由此開創了抗生素作為飼料添加劑使用的先河。此后的研究還發現,抗生素具有提高飼料利用率,提高產蛋率、孵化率及預防疾病的效果,使得大量的抗生素應用于動物生產[10]。從本試驗也不難看出,以金霉素、土霉素和強力霉素為代表的常用作飼料添加劑的抗生素確有比較好的抗菌效果,尤其在對金黃色葡萄球菌要好于抗菌肽,但是對大腸桿菌的效果則要差得多。分析其原因,可能是作為革蘭氏陽性菌的金黃色葡萄球菌與革蘭氏陰性菌在細胞膜的結構上存在很大差異。革蘭氏陰性菌的細胞膜外側面含有大量的帶有負電荷的脂多糖(LPS),而抗菌肽本身是一種陽離子肽,攜帶大量的正電荷,因此很容易與其結合,形成離子通道,穿透細胞膜致死細菌。革蘭氏陽性菌的細胞膜主要成分是肽聚糖(peptidoglycan,或稱粘肽mucopeptide),由于其含有一些磷壁酸和氨基酸羧基而帶有一定量的負電荷,這可能是導致其對抗菌肽的敏感性低于陰性菌的重要原因。不過這方面的研究報道也不盡一致,也有報道稱某些抗菌肽對金黃色葡萄球菌有較好的抑制效果[2,11]。這可能是由于選擇的葡萄球菌的菌株不同,或者使用了不同來源的抗菌肽的緣故。正如試驗中的Indolicidin,對葡萄球菌的抑制效果就比較明顯。試驗用的抗菌肽相互之間在活性上也存在較大差異,有些效果好于抗生素,有些不如抗生素。這是由抗菌肽自身的結構及其來源所決定的,正如抗生素相互之間的抗菌效果也有差別一樣,我們正是要通過試驗選擇理想的抗菌肽作為抗生素的替代品。另外,抗菌肽還有抗真菌[2,4,12,13]、病毒[14,15]和原生動物[2]等作用。薄層瓊脂糖孔穴擴散試驗還進一步證明了抗菌肽的抑菌效果更徹底。這些都是抗生素所不及的。本試驗中一些抗菌劑對細菌沒有表現出明顯的抑制效果,并不是說它沒有抗菌活性,只是試驗濃度范圍內沒有觀察到,如果加大濃度,很可能會有抗菌效果出現。已有試驗測得lactoferrincin(牛)對金黃色葡萄球菌HG386的MIC是75 mg/L,這也為我們針對不同的細菌選擇不同的抗菌劑提供了依據。同時,如果以后抗菌肽作為抗生素的替代品添加到飼料中,這也可以指導最終的添加量。此外,抗菌肽之間的協同、拮抗作用的研究還不是很多,只有少量報道稱一些抗菌肽之間存在協同作用[1],未見有拮抗作用的報道。相信隨著對抗菌肽研究的進一步深入以及現代生物技術的發展,抗菌肽將會為抗菌治療及新藥的開發帶來廣闊的前景。
參考文獻:略
上海邦成 發表于 2010-12-9 16:31
抗菌肽在國外已有20多年的歷史了，最早是用在人醫上的。代替抗生素還是很有效果的！！！
huangkaimin08 發表于 2010-12-9 18:40
美國在人藥上進入第三期臨床試驗。
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