Analysis of influence factors not included in definition during enzyme activity test
Tang Haiou, Wang Yong, Li Fuwei
飼用酶制劑是應用現代生物工程技術，選用特殊的微生物菌株經發酵產生的具有催化活性的生物制劑。近年來，因其具有改善畜禽消化道功能、降低食糜粘度和抗營養性、提高飼料利用率和減少環境污染等特點，已作為環保型飼料添加劑廣泛應用于畜牧業。但因飼用酶制劑應用開發較晚，當前飼用酶制劑酶活測定方法除了植酸酶外其它酶制劑都還沒有一個全國通用的標準方法。雖然隨著酶制劑工業的發展，酶活檢測水平已得到了相應的提高，對于酶活檢測中的一些重要因素人們在酶活定義中已經進行了明確的規定，例如其中的溫度、pH值、時間、底物等，并且對于這些因素在酶活測定過程中對結果的影響程度以及這些因素不同值下的對比關系，廣大科研工作者已經進行了大量而深入的研究。但是酶活檢測過程中除了這些定義中規定的因素對酶活檢測結果影響很大以外，許多非定義因素對酶活的檢測結果影響也極其顯著。因此，對于酶制劑酶活大小的判斷和對比，不能僅僅從定義中規定的因素進行分析，那些非定義因素的分析也至關重要。有鑒于此，筆者就酶制劑酶活測定中一些影響酶活測定值的非定義因素進行了分析，并對其中有些不確定的影響因素進行了對比試驗，以便為廣大的酶制劑應用者更好的把握酶制劑的質量提供參考。
1 緩沖液的配置
飼用酶制定義中的pH值的確定都是根據動物的胃腸內最佳作用pH值得來，一般在5.0～5.5左右。為了達到酶活定義所要求的pH值范圍，酶制劑檢測時都應用一定的緩沖液調配使反應體系達到相應的pH值。反應體系中緩沖液的離子強度影響酶制劑的蛋白空間結構，從而影響其催化能力，所以測定酶活時應盡可能統一反應緩沖液的種類和離子強度。但是在pH相同的條件下如果緩沖液的離子對和緩沖溶液的摩爾濃度不相同，則測定出來的酶活差別很大。乙酸緩沖液在酶制劑檢測中最常使用，但也有方法使用檸檬酸和硼酸等緩沖液。緩沖液摩爾濃度國內方法一般用0.1和0.2M的居多，在國外也有使用0.05M的方法。Nelson等(2007)試驗證明，使用檸檬酸緩沖液測定真菌性植酸酶的活性僅相當于使用乙酸緩沖液的65～70%。然而，在緩沖液使用上的差異并不對所有植酸酶都產生相同的影響。Dalsgaard等(2007)發現，乙酸緩沖液和檸檬酸緩沖液對兩種大腸桿菌植酸酶的相對酶活影響區別很大，用檸檬酸緩沖液分析得到的植酸酶活性只相當于用乙酸緩沖液的1/3左右。我們應用相同測定方法不同的兩種的緩沖液測定同一種木聚糖酶樣品，結果表明使用乙酸緩沖液測定的酶活僅相當于使用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液的60～70%。
2 底物的配置
底物的差別對酶活測定結果具有很大影響。底物的選擇最好應用酶制劑實際應用時所對應的酶解底物為好，但是在實際檢測時因為考慮到底物穩定性以及酶活檢測的方便性等問題，底物的性質和型號往往有很大的區別。對于沒有統一國標規定的測定方法，在底物的性質上存在許多不同，其中多以鹽的形式居多，例如纖維素酶的底物以用羧甲基纖維素鈉為多，但也有直接用微晶體纖維素進行測定的方法。即便是植酸酶的底物植酸鈉也存在不同種型號的情況，應用不同型號的植酸鈉進行測定，結果之間差別也很顯著。我們采用試驗的方式考察了不同pH條件下二種底物(SigmaP8810和P3168)檢測不同酶活水平的植酸酶時其檢測值之間的差別。結果表明：不同pH條件下，P8810與P3168的檢測結果之間差異都極顯著(見表1)。
表1 不同pH下三種底物對不同酶活水平的植酸酶檢測結果及分析