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畜牧人

標題: 植物蘇云金芽孢桿菌蛋白(BT)酶聯免疫分析 [打印本頁]

作者: kiroco 時間: 2014-2-20 15:53
標題: 植物蘇云金芽孢桿菌蛋白(BT)酶聯免疫分析
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中植物蘇云金芽孢桿菌蛋白(BT)水平.用純化的植物蘇云金芽孢桿菌蛋白(BT)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入蘇云金芽孢桿菌蛋白(BT),再與HRP標記的蘇云金芽孢桿菌蛋白(BT)抗體結合,形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,經過徹底洗滌后加底物TMB顯色.TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成最終的黃色.顏色的深淺和樣品中的蘇云金芽孢桿菌蛋白(BT)呈正相關.用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算樣品中植物蘇云金芽孢桿菌蛋白(BT)濃度.
試劑盒組成:
試劑盒組成
48孔配置
96孔配置
保存
說明書
1份
1份
封板膜
2片(48)
2片(96)
密封袋
1個
1個
酶標包被板
1×48
1×96
2-8℃保存
標準品:900ng/g
0.5ml×1瓶
0.5ml×1瓶
2-8℃保存
標準品稀釋液
1.5ml×1瓶
1.5ml×1瓶
2-8℃保存
酶標試劑
3 ml×1瓶
6 ml×1瓶
2-8℃保存
樣品稀釋液
3 ml×1瓶
6 ml×1瓶
2-8℃保存
顯色劑A液
3 ml×1瓶
6 ml×1瓶
2-8℃保存
顯色劑B液
3 ml×1瓶
6 ml×1瓶
2-8℃保存
終止液
3ml×1瓶
6ml×1瓶
2-8℃保存
濃縮洗滌液
(20ml×20倍)×1瓶
(20ml×30倍)×1瓶
2-8℃保存
樣本處理及要求:
1. 血清:室溫血液自然凝固10-20分鐘,離心20分鐘左右(2000-3000轉/分).仔細收集上清,保存過程中如出現沉淀,應再次離心.
2. 血漿:應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉/分).仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應該再次離心.
3. 尿液:用無菌管收集,離心20分鐘左右(2000-3000轉/分).仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心.胸腹水,腦脊液參照實行.
4. 細胞培養上清:檢測分泌性的成份時,用無菌管收集.離心20分鐘左右(2000-3000轉/分).仔細收集上清.檢測細胞內的成份時,用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細胞懸液,細胞濃度達到100萬/ml左右.通過反復凍融,以使細胞破壞并放出細胞內成份.離心20分鐘左右(2000-3000轉/分).仔細收集上清.保存過程中如有沉淀形成,應再次離心.
5. 組織標本:切割標本后,稱取重量.加入一定量的PBS,PH7.4.用液氮迅速冷凍保存備用.標本融化后仍然保持2-8℃的溫度.加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或勻漿器將標本勻漿充分.離心20分鐘左右(2000-3000轉/分).仔細收集上清.分裝后一份待檢測,其余冷凍備用.
6. 標本采集后盡早進行提取,提取按相關文獻進行,提取后應盡快進行實驗.若不能馬上進行試驗,可將標本放于-20℃保存,但應避免反復凍融.
7. 不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性.
操作步驟:
標準品的稀釋與加樣:在酶標包被板上設標準品孔10孔,在第一,第二孔中分別加標準品100μl,然后在第一,第二孔中加標準品稀釋液50μl,混勻;然后從第一孔,第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔,再在第三,第四孔分別加標準品稀釋液50μl,混勻;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉,再各取50μl分別加到第五,第六孔中,再在第五,第六孔中分別加標準品稀釋液50ul,混勻;混勻后從第五,第六孔中各取50μl分別加到第七,第八孔中,再在第七,第八孔中分別加標準品稀釋液50μl,混勻后從第七,第八孔中分別取50μl加到第九,第十孔中,再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl,混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉.(稀釋后各孔加樣量都為50μl,濃度分別為600 ng/g,400 ng/g ,200 ng/g,100ng/g, 50 ng/g).
加樣:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同),待測樣品孔.在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣品最終稀釋度為5倍).加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻.
溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘.
配液:將30(48T的20倍)倍濃縮洗滌液用蒸餾水30(48T的20倍)倍稀釋后備用.
洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復5次,拍干.
加酶:每孔加入酶標試劑50μl,空白孔除外.
溫育:操作同3.
洗滌:操作同5.
顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘.
終止:每孔加終止液50μl,終止反應(此時藍色立轉黃色).
測定:以空白空調零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值). 測定應在加終止液后15分鐘以內進行.
注意事項:
試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,酶標包被板開封后如未用完,板條應裝入密封袋中保存.
濃洗滌液可能會有結晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結果.
各步加樣均應使用加樣器,并經常校對其準確性,以避免試驗誤差.一次加樣時間最好控制在5分鐘內,如標本數量多,推薦使用排槍加樣.
請每次測定的同時做標準曲線,最好做復孔.如標本中待測物質含量過高(樣本OD值大于標準品孔第一孔的OD值),請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(n倍)后再測定,計算時請最后乘以總稀釋倍數(×n×5).
封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染.
底物請避光保存.
嚴格按照說明書的操作進行,試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理.
本試劑不同批號組分不得混用.
10. 如與英文說明書有異,以英文說明書為準.
計算:
以標準物的濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,
在坐標紙上繪出標準曲線,根據樣品的OD
值由標準曲線查出相應的濃度;再乘以稀釋
倍數;或用標準物的濃度與OD值計算出標
準曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值
代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋
倍數,即為樣品的實際濃度.
試劑盒性能:
1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.95以上.
2.批內與批見應分別小于9%和11%
檢測范圍:
30ng/g-800ng/g

作者: kiroco 時間: 2014-2-20 15:55
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