玉米赤霉烯酮對斷奶小母豬生產性能、血清抗氧化功能和免疫功能的影響

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玉米赤霉烯酮對斷奶小母豬生產性能、血清抗氧化功能和免疫功能的影響

楊立杰 王淑靜 楊維仁 黃麗波 劉法孝 姜淑貞 楊在賓

　　摘要：為了研究不同水平玉米赤霉烯酮 (zearalenone, ZEA) 污染飼糧對斷奶小母豬生產性能、血清抗氧化功能、血清抗體水平及外周血淋巴細胞增殖率的影響。將40頭健康三元雜交 (杜×長×大) 斷奶小母豬按日齡[ (35±1) 日齡]和平均體重[ (14.01±0.86) kg]分為4組, 對照組飼喂基礎飼糧 (ZEA水平的測定值為0 mg/kg) , 試驗組在基礎飼糧中分別添加0.5、1.0及1.5 mg/kg ZEA[ZEA水平的測定值分別為 (0.52±0.07) mg/kg、 (1.04±0.03) mg/kg和 (1.51±0.13) mg/kg]。預試期10 d, 正試期35 d。結果表明:飼糧ZEA對斷奶小母豬平均日采食量、平均日增重和料重比沒有顯著影響(P>0.05) 。與對照組相比, ZEA顯著降低了血清谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-Px, 0.5、1.0和1.5 mg/kg ZEA) 活性、豬瘟 (1.0和1.5 mg/kg ZEA) 和偽狂犬病病毒抗體水平 (1.5 mg/kg ZEA) 以及外周血淋巴細胞增殖率 (1.0和1.5 mg/kg ZEA) (P<0.05) , 而顯著升高了血清丙二醛 (MDA, 0.5、1.0和1.5 mg/kgZEA)含量 (P<0.05) 。隨著飼糧中ZEA水平的升高, 斷奶小母豬的料重比呈一次線性降低趨勢 (P=0.075) ,血清GSH-Px、超氧化物歧化酶 (SOD) 活性, 血清病毒 (豬瘟、偽狂犬病和高致病性豬藍耳病病毒)抗體水平和外周血淋巴細胞增殖率均呈一次線性降低 (P<0.05) , 而血清MDA含量則呈一次線性升高 (P<0.05) 。由此可見, 飼糧中0.5 mg/kg的ZEA足以誘導小母豬的氧化應激反應, 1.0 mg/kg的ZEA能夠顯著降低斷奶小母豬的特異性體液免疫和細胞免疫功能。

　　關鍵詞：玉米赤霉烯酮; 斷奶小母豬; 生產性能; 谷胱甘肽過氧化物酶; 丙二醛; 抗體水平; 淋巴細胞增殖率;

　　玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEA) 又名F&#8259;2毒素, 是由鐮刀菌產生的一種2,4-二羥基苯甲酸內酯類化合物[1]。調查結果顯示, ZEA是中國飼料原料及配合飼料檢出水平最高的霉菌毒素之一[2]。飼料中較高水平的ZEA能夠引起母豬不孕、流產和假發情等繁殖障礙[3], 長期飼喂低水平ZEA飼料,造成母豬發情周期延長、產仔數減少、仔豬體弱、死胎和不育[4], ZEA已經成為養豬業的第二大殺手[5-6]。國內外有關ZEA的研究多集中在生殖系統[7], 而ZEA對斷奶小母豬血清抗氧化功能、血清抗體水平及外周血淋巴細胞增殖率的影響尚未見系統報道。本試驗旨在研究飼糧中不同水平ZEA (0.5~1.5 mg/kg) 對斷奶小母豬生長性能, 血清抗氧化功能, 血清豬瘟、偽狂犬病和高致病性豬藍耳病病毒抗體水平及外周血淋巴細胞增殖率的影響, 以期揭示ZEA的氧化應激和免疫毒性,為ZEA的毒性機制及養豬生產中相關疾病的防治和繁殖障礙提供理論依據和思路。

　　1 材料與方法

　　1.1 試驗材料

　　ZEA購自于以色列Fermentek公司, 色譜純, 純度保證值為98%。

　　1.2 試驗設計與飼養管理

　　選擇25~28日齡健康的三元雜交 (杜×長×大) 斷奶雌性小母豬40頭, 在產床上繼續飼養10 d,然后轉入試驗籠, 單籠 (0.48 m) 飼養, 根據日齡[ (35±1) 日齡]和平均體重[ (14.01±0.86) kg]分成4組,每組10頭, 組間初始體重差異不顯著 (P>0.05) 。斷奶小母豬基礎飼糧參考NRC (2012) 營養需要配制, 其組成及營養水平見表1。對照組飼喂基礎飼糧, 試驗組在基礎飼糧中分別添加0.5、1.0和1.5 mg/kg ZEA, ZEA測定值分別為(0.52±0.07) mg/kg、 (1.04±0.03) mg/kg和1.51±0.13 mg/kg。預試期10 d, 正試期35 d。

　　單體籠使用塑料漏縫地板, 安裝有乳頭飲水器和料槽, 小母豬自由采食和飲水。試驗開始前對豬舍進行全面清掃、消毒, 試驗期間每周進行1次豬舍消毒。舍內安裝紅外保溫燈, 第1周維持試驗籠內溫度在30℃左右, 第2周將豬舍內環境溫度維持在26~28℃。豬舍相對濕度為65%。預試期10 d, 正試期35 d, 自由采食飲水。小母豬管理和免疫按常規進行。其中, 豬瘟病毒疫苗于小母豬出生后第21天肌肉注射;偽狂犬病病毒疫苗于小母豬出生后72 h內滴鼻, 第28天進行2次免疫;高致病性豬藍耳病病毒疫苗于小母豬出生第14天進行肌肉注射免疫。試驗結束后小母豬全部屠宰。動物試驗于2016年4—6月在山東農業大學畜牧科技園進行。

　　1.3 ZEA污染飼糧的配制

　　將色譜純 (純度為98%) 的晶體粉末狀ZEA由乙酸乙酯溶解制成溶液, 再將含有ZEA的乙酸乙酯溶液噴灑到一定量的滑石粉載體上, 并放置過夜使乙酸乙酯揮發, 制成1 000 mg/kg的ZEA預混劑,然后用不含毒素的玉米粉進一步將1 000 mg/kg的ZEA預混劑稀釋成10 mg/kg的ZEA預混劑, 最后按照各組飼糧中ZEA的設計水平, 用ZEA預混劑替代配方中的玉米和載體配制成試驗飼糧。試驗所需飼糧于試驗正式開始前1周一次性配合完成, 裝袋后儲存于干燥通風處。在試驗前和試驗結束分別取樣后, 立即進行飼糧中養分含量和毒素水平檢測。取樣方法按照《飼料采樣方法》 (GB/T 14699.1—1993) 。

　　1.4 飼糧常規養分和毒素的測定

　　飼糧常規養分測定參考AOAC(2012) 的方法進行。粗蛋白質含量用凱氏定氮法測定;消化能用HR-15氧彈式熱量計測定;鈣含量根據高錳酸鉀滴定法測定;總磷含量根據鉬黃比色法測定;氨基酸含量用日立835-50氨基酸自動分析儀進行測定。

　　飼糧毒素水平測定:飼糧中ZEA、嘔吐毒素、黃曲霉毒素和煙曲霉毒素水平委托青島出入境檢測檢疫局測定。采用免疫親和柱層析凈化, 以液相色譜法熒光檢測器測定ZEA和黃曲霉毒素的水平, 外標法定量。采用免疫親和層析凈化高效液相色譜-串聯質譜法, 以液相色譜結合紫外檢測器測定煙曲霉毒素和嘔吐毒素的水平, 外標法定量。黃曲霉毒素、ZEA、嘔吐毒素和煙曲霉毒素的最低檢測限分別為1.0μg/kg、0.1 mg/kg、0.1 mg/kg和0.25 mg/kg。各組飼糧ZEA的實際測定值分別為0 mg/kg (0、0) mg/kg, (0.52±0.07) mg/kg (0.59、0.45 mg/kg) , (1.04±0.03) mg/kg (1.01、1.07 mg/kg) 和 (1.51±0.13) mg/kg (1.38、1.64 mg/kg) (括號內為2次的測定值) , 2次均未檢測到其他毒素或者毒素水平低于檢測限水平。

　　1.5 樣品采集與指標測定

　　1.5.1 生長性能測定

　　每天記錄小母豬采食量與剩料量, 試驗前后對小母豬進行稱重, 計算平均日增重 (ADG) 、平均日采食量 (ADFI) 和料重比 (F/G) 。

　　1.5.2 血樣的采集、處理與測定

　　正試期第35天晨飼前, 對小母豬進行前腔和耳緣靜脈空腹采血。使用真空抗凝管 (內加K2EDTA) 采集耳緣靜脈全血15 mL, 采血后立即顛倒混勻8次, 血液標本于0℃中暫存, 立即帶回實驗室用于測定外周血淋巴細胞增殖率。另用真空促凝管采集前腔靜脈血30 mL, 于3 000 r/min下離心10 min分離血清, 用以測定抗體水平、抗氧化功能。

　　1.5.3 血清抗氧化功能分析

　　血清中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH&#8259;Px) 、超氧化物歧化酶 (SOD) 活性、丙二醛 (MDA) 含量均采用752型紫外可見分光光度計測定,具體步驟按照試劑盒說明書進行測定。GSH&#8259;Px試劑盒 (A005)、MDA試劑盒 (A003) 和SOD試劑盒 (A001&#8259;1) 購于南京建成生物工程研究所。

　　1.5.4 血清抗體水平分析

　　按照豬瘟、偽狂犬病和高致病性豬藍耳病病毒抗體酶聯免疫吸附測定 (ELISA) 試劑盒 (CIVTEST SUISHC/PPC, 法國LSI公司) 說明書步驟進行操作, ELISA儀 (FAME 24/20, 瑞士HAMILTON公司) 測450 nm波長下吸光度 (OD) 值, 與ELISA試劑盒中標準品及其對應OD值進行比對, 進行抗體水平分析。

　　1.5.5 外周血淋巴細胞增殖率的測定

　　血液預處理:將全血與D&#8259;Hanks溶液按1∶1混合, 加入到淋巴細胞分離液中于2000 r/min離心30 min。取中間白細胞部分, 用紅細胞裂解液裂解其中紅細胞后, 用RPMI-1640 (美國Hyclone公司) 清洗3次, 每次清洗后離心5 min (2 000 r/min) , 用臺盼藍染色計數活細胞數 (應在95%以上) , 然后將脾淋巴細胞懸浮于RPMI-1640完全培養液調整細胞密度到2×10個/mL。

　　淋巴細胞增殖率測定:將上述細胞懸液分加于96孔培養板中, 每孔190μL, 同時加10μL伴刀豆凝集素A(ConA) 。將培養板置于5%的CO2培養箱內, 37℃培養72 h。培養結束前4 h, 每孔加入100μL 3- (4, 5-二甲基噻唑-2) -2, 5-二苯基四氮唑溴鹽 (MTT) , 繼續培養。培養結束后, 每孔吸出100μL上清液, 加入100μL二甲基亞砜 (DSMO) 溶解紫色結晶產物, 用酶聯免疫檢測儀在570 mn波長下測定OD值。以對照組吸光度值為1, 將試驗組與對照組進行比較, 分析得出各試驗組細胞數量相對于對照組的百分比, 即為淋巴細胞增殖率。

　　1.6 數據處理與分析

　　數據分析采用SAS 9.2統計軟件, 各組間差異采用單因素方差(one&#8259;way ANOVA) 分析, 采用正交多項式比較法對不同ZEA水平梯度的處理效應進行一次線性回歸分析, 用Duncan氏多組極差檢驗法進行多重比較, 顯著性水平P<0.05。

　　2 結果與分析

　　2.1 ZEA對斷奶小母豬生長性能的影響

　　由表2可知, ZEA對斷奶小母豬的平均日增重、平均日采食量和料重比均沒有顯著影響 (P>0.05)。但是, 隨著飼糧ZEA水平的升高, 飼糧料重比呈一次線性降低的趨勢 (P=0.075) 。

　　2.2 ZEA對斷奶小母豬血清抗氧化功能的影響

　　由表3可知, 與對照組相比, 0.5、1.0和1.5 mg/kgZEA組的血清GSH&#8259;Px活性均顯著降低(P<0.05) ,而血清MDA含量則顯著升高 (P<0.05) 。隨著飼糧ZEA水平的增加, 血清GSH&#8259;Px和SOD活性呈一次線性降低(P<0.05) , 血清MDA含量則呈一次線性升高 (P<0.05) 。

　　2.3 ZEA對斷奶小母豬血清抗體水平的影響

　　由表4可知, 1.5 mg/kgZEA組的血清豬瘟、偽狂犬病病毒抗體水平均顯著低于對照組 (P<0.05) , 1.0 mg/kg ZEA組的血清豬瘟病毒抗體水平顯著低于對照組 (P<0.05), 各組間的血清高致病性豬藍耳病病毒抗體水平差異不顯著 (P>0.05) 。隨著飼糧ZEA水平的增加, 斷奶小母豬的血清豬瘟、偽狂犬病和高致病性豬藍耳病病毒抗體水平均呈一次線性降低 (P<0.05) 。

　　2.4 ZEA對斷奶小母豬外周血淋巴細胞增殖率的影響

　　由圖1可知, 與對照組相比, 1.0和1.5 mg/kgZEA組的外周血淋巴細胞增殖率顯著降低 (P<0.05) ,而0.5 mg/kg組無顯著變化 (P>0.05) 。隨著飼糧ZEA水平的增加, 斷奶小母豬的外周血淋巴細胞增殖率呈一次線性降低 (P<0.05) 。

　　3 討論

　　近期有關ZEA在動物飼糧中的研究, 多是采用已知ZEA水平的天然污染飼糧為試驗材料[1,8-10]。為了避免天然污染飼糧中, 其他毒素對ZEA毒性的機制研究產生的干擾, 本研究選擇高純度ZEA, 在本實驗室前期研究結果[1,3,9-10]基礎上, 繼續探索較低水平ZEA (0.5~1.5 mg/kg) 對斷奶小母豬的氧化應激和免疫毒性。

　　3.1 ZEA對斷奶小母豬生長性能的影響

　　ZEA在斷奶小母豬平均日采食量、平均日增重及料重比方面的研究結論并不一致。有研究報道, 斷奶仔豬飼糧中添加3 mg/kg的ZEA沒有顯著影響仔豬平均日采食量、平均日增重和料重比[11]。飼糧添加1~3 mg/kg的ZEA對仔豬的平均日增重和料重比也沒有顯著改變[12]。然而Powell&#8259;Jones等[13]研究發現, ZEA具有潛在促生長作用, 而在結論中, 并未對ZEA具體水平進行分析。本研究條件下, 飼糧中添加0.5~1.5 mg/kg ZEA對小母豬的平均日采食量、平均日增重和料重比均沒有顯著影響, 但值得一提的是, 斷奶小母豬的料重比隨著ZEA水平的增加呈現出線性降低趨勢 (P=0.075) , 表明低水平 (0.5~1.5 mg/kg) ZEA具有潛在的促生長作用。另有報道顯示, 隨著飼糧中ZEA水平 (3.0~9.0 mg/kg) 的增加, 母豬 (初始體重為64 kg) 的采食量、平均日增重和飼糧報酬均呈現下降趨勢[14]。綜上所述, 飼糧中不同水平的ZEA在生豬不同生長階段具有不同的作用效果, 有關ZEA水平與動物生長性能之間的相關性及其作用機理的研究, 尚需進一步研究證實。

　　3.2 ZEA對斷奶小母豬血清抗氧化功能的影響

　　自由基反應對動物機體的防御機制是必要的, 正常動物體內自由基的產生與清除處于動態平衡。研究表明, ZEA能夠刺激動物機體產生氧化應激[15-16], 使機體氧化能力超過抗氧化能力, 進而增加動物體內氧自由基的數量, 最終導致生物膜脂過氧化[17-18]。飼糧中添加2.0和3.2 mg/kg ZEA使仔豬血清中GSH&#8259;Px的活性顯著低于不添加ZEA組[19]。血清MDA含量作為反映細胞損傷的生物標記物, 在本研究條件下, 對照組血清MDA含量均顯著低于ZEA組, 且隨著ZEA水平的增加呈一次線性增加;對照組血清GSH&#8259;Px活性顯著高于ZEA組, 隨著ZEA水平增加呈一次線性下降。我國《飼料衛生標準》規定仔豬飼糧中ZEA最高限定水平為0.5 mg/kg (GB 13078.2—2006) , 歐盟關于仔豬飼糧中ZEA的最高限定水平為0.1mg/kg[20]。值得強調的是, 本研究條件下, 飼糧中添加0.5 mg/kg ZEA足以能夠引起仔豬氧化應激反應, 使機體血清抗氧化功能顯著降低, 給我國《飼料衛生標準》仔豬飼糧中ZEA限量標準提供了理論依據。盡管研究者們對ZEA降低血清抗氧化功能的觀點普遍認可[21-23], 但尚未見低水平ZEA對動物機體啟動過氧化機制的研究報道, 其分子機制有待畜牧工作者進行更深層次的探究。

　　3.3 ZEA對斷奶小母豬血清抗體水平的影響

　　豬瘟、偽狂犬病和高致病性豬藍耳病均是對仔豬健康有巨大威脅的傳染病。多數情況下, 免疫接種能夠起到相對理想的效果, 但是多年來免疫失敗或豬群體免疫反應低下的現象也是屢見不鮮, 成為疫情爆發的重大安全隱患。報道顯示, 正常豬瘟免疫18 d后, 2.0和3.2 mg/kg ZEA組仔豬體內豬瘟病毒抗體水平顯著低于對照組[24]。本研究結果顯示, 飼糧中添加1.0和1.5 mg/kg ZEA能夠顯著降低豬瘟病毒抗體水平, 且1.5 mg/kg ZEA組偽狂犬病病毒抗體水平顯著低于對照組;豬瘟、偽狂犬病和高致病性豬藍耳病病毒抗體水平隨著飼糧中ZEA水平的增加均呈一次線性下降, 提示ZEA抑制了病毒抗體的產生, 對斷奶小母豬體液免疫功能產生了負面影響。單一毒素ZEA啟動機體病毒抗體水平降低的最低水平尚未見報道, 因此飼糧中ZEA水平與斷奶小母豬體內病毒抗體水平變化的相關性探索及其機理, 將是本課題組接下來的重要研究內容之一。

　　3.4 ZEA對斷奶小母豬外周血淋巴細胞增殖率的影響

　　淋巴細胞的增殖能力是反映細胞免疫功能的一項重要指標。Lioi等[25]研究發現, ZEA能夠抑制牛淋巴細胞的增殖;另有研究顯示, ZEA能夠極顯著抑制離體小鼠脾臟T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖[26-27]。眾多研究表明, 離體條件下ZEA可使淋巴細胞內環境穩態失調而發揮免疫毒性作用, 對小鼠外周血淋巴細胞產生直接毒害作用[28-30]。前人關于ZEA對淋巴細胞增殖率的研究結論, 大多是在離體條件下得出的, 而采食ZEA飼糧對斷奶小母豬外周血淋巴細胞增殖率的研究卻鮮有報道。本研究結果表明, 飼糧中添加1.0 mg/kg的ZEA能夠使小母豬外周血淋巴細胞增殖率顯著降低,提示飼糧中1.0 mg/kg ZEA足以誘導小母豬的細胞免疫。本課題組將通過細胞和分子生物學手段,進一步探索飼糧中ZEA水平與斷奶小母豬細胞免疫和體液免疫的相關性。

　　4 結論

　　①飼糧中0.5~1.5mg/kg ZEA對斷奶小母豬生長性能沒有顯著影響, 但小母豬料重比隨飼糧ZEA水平的升高呈一次線性降低。

　　②飼糧0.5 mg/kgZEA足以誘導斷奶小母豬血清的氧化應激反應, 血清GSH&#8259;Px活性顯著降低, 血清MDA含量則顯著升高, 且二者隨飼糧ZEA水平升高呈一次線性變化。

　　③飼糧1.0 mg/kgZEA足以誘導斷奶小母豬的體液免疫和細胞免疫反應, 血清病毒 (豬瘟、偽狂犬病和高致病性豬藍耳病病毒) 抗體水平和外周血淋巴細胞增殖率隨飼糧ZEA水平增加均呈一次線性降低。

　　本文來源：  母豬母儀天下之豬