美國農(nóng)業(yè)部研究機(jī)構(gòu)利用納米孔測(cè)序技術(shù)快速鑒定非洲豬瘟病毒基因組

畜牧人小李

非洲豬瘟病毒（ASFV）是非洲豬瘟病毒科家族的唯一成員，是一種大型（200nM）復(fù)雜的囊膜雙鏈DNA病毒。ASFV可感染家豬和野豬，擴(kuò)散快，致死率高（可達(dá)100%），對(duì)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)后果。

近期，美國農(nóng)業(yè)部下屬的研究機(jī)構(gòu)在Journal of Clinical Microbiology雜志上發(fā)表了針對(duì)非洲豬瘟病毒的首個(gè)結(jié)合樣品富集、納米孔MinION測(cè)序技術(shù)、以及新型快速分析軟件的報(bào)告，實(shí)現(xiàn)對(duì)該病毒基因組序列的真正實(shí)時(shí)檢測(cè)。

由于目前尚無控制非洲豬瘟（ASF）的有效疫苗，基于檢測(cè)追蹤、流行病學(xué)調(diào)查、減少人員接觸以及消毒等控制措施，在當(dāng)病毒脫落或其他的病毒和細(xì)菌感染產(chǎn)生相似的癥狀時(shí)，這些方法就會(huì)變得非常復(fù)雜。因此，分子水平進(jìn)行早期快速檢測(cè)和診斷有益于早期發(fā)現(xiàn)和更加有效的控制豬瘟。

美國農(nóng)業(yè)部國家獸醫(yī)服務(wù)實(shí)驗(yàn)室等研究機(jī)構(gòu)比較了現(xiàn)有的測(cè)序平臺(tái)，發(fā)現(xiàn)基于NGS平臺(tái)的工作流程需要大量資源進(jìn)行樣本和測(cè)序文庫準(zhǔn)備，檢測(cè)周期長（最少17個(gè)小時(shí)來獲取原始數(shù)據(jù)），儀器投入資本高。另外，ASFV基因組大小約為180kb，兩端為反向重復(fù)序列，該病毒的大小也一直阻礙著獲得其全基因組序列的研究工作。而在滿足快速檢測(cè)和鑒定ASFV的需求上，MinION測(cè)序儀具備了低前期投資成本、快速樣本制備方案、可生成有效覆蓋基因組的長讀長序列、可直接讀取DNA，并且能夠?qū)崟r(shí)生成數(shù)據(jù)的優(yōu)勢(shì)。

基于便攜式MinION納米孔測(cè)序，他們開發(fā)出了非洲豬瘟快速分析測(cè)序工具（ASF-FAST）和富集策略，能夠在數(shù)分鐘內(nèi)獲得并快速分析非洲豬瘟病毒基因組，該方法有助于高效的緊急管理和疾病控制干預(yù)，減少經(jīng)濟(jì)損失。結(jié)果顯示測(cè)序開始后的6分鐘內(nèi)便檢測(cè)到ASFV的特異讀長，無論起始材料，均能夠在10分鐘內(nèi)生成足夠的數(shù)據(jù)完成ASFV的基因組分析（高達(dá)100%）。該研究成果發(fā)表在Journal of Clinical Microbiology雜志。DOI: 10.1128/JCM.01104-19。

在實(shí)驗(yàn)中，研究小組比較了未處理樣品和富集樣品的序列特異度和時(shí)間，發(fā)現(xiàn)從富集的樣品中識(shí)別到ASFV基因組更快，更富特異性。在富集的樣品中，生成總讀長序列54743個(gè)，其中23208個(gè)含有ASFV特異性序列（42.39%），生成的第一個(gè)原始讀長即識(shí)別到了99%的基因組；對(duì)于未處理的樣品，生成了4307個(gè)總讀長序列，其中868個(gè)含有ASFV特異性序列（20.15%）。另外，去除甲基化宿主DNA提升了病毒特異性測(cè)序性能。

在生成完整基因組序列所需的時(shí)間方面，富集樣本速度更優(yōu)于未處理樣本：生成99%的基因組序列，富集后的樣本僅需不到10分鐘，而未處理樣本則需要64分鐘。證實(shí)將長讀長納米孔測(cè)序技術(shù)與ASF-FAST軟件結(jié)合使用，能夠經(jīng)濟(jì)快速，實(shí)時(shí)地從診斷樣品中分離出完整的ASFV基因組。

在評(píng)估MinION平臺(tái)用于流行病學(xué)評(píng)估的快速鑒定的可行性方面，作者使用ASF -FAST軟件分析了四株遺傳學(xué)上不同的ASFV分離株的序列數(shù)據(jù)。他們發(fā)現(xiàn)在測(cè)序運(yùn)行開始的10分鐘內(nèi)，所有富集樣本90%的基因組均得到了解析。使用新鮮的和凍干血液樣本，全基因組序列可在約4小時(shí)內(nèi)獲得。

作者在文章最后表示，納米孔技術(shù)作為一種重要的工具，能夠被世界其它許多受ASFV威脅的地方和地區(qū)所利用進(jìn)行快速監(jiān)視，應(yīng)用于那些沒有復(fù)雜基礎(chǔ)設(shè)施的實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都可以以最小的資金投入輕松獲得MinION設(shè)備，迅速拓展能力進(jìn)行對(duì)ASFV的表征。

近期，中國科學(xué)院武漢病毒研究所劉翟課題組也利用納米孔測(cè)序技術(shù)成功解析一例非洲豬瘟病毒基因組。

制版人：半夏

來源：BioArt