葛根素的提取及結構改造

魁罡

葛根素是由豆科植物野葛（Pueraria lobata(wild.)Ohwi）或甘葛藤（Pueraria thomsonii Benth.）的干燥根中分離提取出的一種黃酮苷，化學名為4′,7-二羥基－8－D－葡萄糖基異黃酮。作為改善心腦血管循環的新藥，葛根素毒性小、安全范圍廣、療效好而極具臨床應用價值[1]。但由于科技投入的不足，生產效率低，能耗大，產品缺乏競爭力。另外，由于其異黃酮結構水溶性和脂溶性都較差，生物利用度低，限制了它的廣泛應用。目前，臨床應用的葛根素注射液大多需加入高濃度的丙二醇才能達到該注射劑要求的藥物濃度，這樣使藥物的粘稠度較大，亦給生產造成過濾上的麻煩，成本增加[2]。實驗證明大鼠灌胃和臨床口服葛根素的生物利用度都比較低，這在一定程度上影響其療效的發揮[3]。因此，探索有效的提取工藝和尋求合適的方法提高葛根素的脂溶性和水溶性，對提高其生物利用度，增強藥理活性具有重要意義。本研究在從野葛中提取葛根素的基礎上，對其提取物葛根素進行了結構改造。同時，考慮到葛根素的水溶性和以往對葛根素的結構修飾主要集中在酚羥基和糖C－6??醇羥上，本研究在3ˊ或5′位引進不同的Mannich堿，以期增強其藥理活性。此方法不但避免了葛根素的主要官能團－酚羥基被也結合或屏蔽，也可以為異黃酮類化合物的結構修飾提供一種新的方法。

1材料與方法1.1 實驗儀器與藥品1.1.1儀器設備
    紫外－可見分光光度計（HITACHI557,美國），紅外分光光度儀（HITACHI220-50，美國DELL公司），核磁共振分析儀(MERCURY 400BBP，美國),旋轉蒸發儀(RE120，德國)，分析天平，量筒，100ml三口圓底燒瓶，100ml、50m滴液漏斗，100ml分液漏斗，500ml三角瓶，水泵，蒸餾裝置（包括常壓蒸餾和減壓裝置），磁力攪拌器，紫外燈，80×3cm層析柱，薄層層析板，電熱套，濾紙等。
1.1.2試劑藥品野葛根(購自蘭州佛慈制藥廠，產地陜西，中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所鑒定)，葛根素標準品(中國藥品生物制品檢定所)，薄層層析硅膠G(青島海洋化工有限公司)，柱層析硅膠（青島海洋化工分廠，粒度：200－300目）。酸性三氧化二鋁、正丁醇、氯仿、六氫吡啶，四氫吡咯，氯仿，乙醇，95%乙醇，無水吡啶、甲醇(均為分析純)，氫氧化鈉（固體），無水硫酸鎂（均為化學純），羧甲基纖維素鈉(CMC)。

2 實驗方法
2.1 葛根素的提取
    采用醇提法[4]，即稱取葛根2000g于三口圓底燒瓶中，加入95%乙醇2000mL,在水浴鍋中（58-60℃）熱浸29h，過濾，濾液備濃縮為浸膏。將浸膏用400mL水飽和正丁醇和400mL正丁醇交替溶解，即在旋轉蒸發儀上旋轉振蕩1h，靜置2h，吸取上清液。上清液用水進行萃取，萃取液濃縮至原體積的一半，再用正丁醇萃取，正丁醇萃取液經三氧化二鋁柱脫色，再經減壓濃縮，濃縮液靜置析出后，抽濾并經自然干燥得粗制品0.75kg。取粗制品75g，加入95%的冰醋酸262mL，加熱至116℃溶解，并結晶得精品28.2g。
2.2 葛根素的結構改造[5.6.7]
2.2.13ˊ－亞甲基－六氫吡啶-葛根素的合成    在三口圓底燒瓶中加入37％－40％的甲醛溶液10mL，在冰浴冷卻的情況下，用滴液漏斗滴加23mL六氫吡啶，維持反應溫度在40℃左右，。滴加完畢后，室溫繼續攪拌2小時，靜置，溶液出現分層現象，上層為淡黃色的有機層，下層為水，移至分液漏斗，分出上層，加氫氧化鈉干燥，過濾，減壓蒸餾，收集85℃－90℃的餾分。精確稱取0.416g葛根素精品與三口圓底燒瓶中，加10mL無水吡啶溶解，溶液顯黃色，用滴液漏斗緩慢滴加0.4027g餾分。加熱攪拌回流，TLC跟蹤反應，反應約需8小時，所得反應液用薄層層析板進行分離（CH3Cl－CH3OH，2：1），得到淡黃色的晶體（106mg，收率26％）。其合成路線如下：

2.63ˊ－亞甲基－四氫吡咯－葛根素的合成
    在三口圓底燒瓶中加入37％－40％的甲醛溶液10mL，在冰浴冷卻的情況下，用分液漏斗滴加16.8mL四氫吡咯，溫度一直保持在50℃以下，同時用磁力攪拌器攪拌，滴加完畢，室溫繼續攪拌2小時，靜置，溶液不分層，深紅色的液體。加氫氧化鈉干燥，放置，過濾，減壓蒸餾，收集100℃－105℃的餾分。精確稱取0.832g葛根素精品與三口圓底燒瓶中，加20mL無水吡啶溶解，用滴液漏斗滴加0.308g餾分，加熱攪拌回流，TLC跟蹤反應，反應約需5小時，停止反應后減壓蒸除溶劑，所得產物經硅膠柱分離（CH3Cl－CH3OH－H2O，95：30：3），得到深紅色的固體結晶（83mg，收率10％），其合成路線如下：
2.3.葛根素及其衍生物的結構鑒定
2.3.1葛根素提取物的純度分析
    稱取干燥至恒重的葛根素5mg，于25mL容量瓶中，加95%的乙醇溶解并稀釋至刻度,吸取0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL溶液 圖3葛根素樣品HNMR圖譜
    置10mL容量瓶，以1.0mL95%乙醇精密加水至10mL，搖勻。同時以1.0ml95%乙醇加水至10mL作空白對照，在250nm波長處測定吸收度。處理數據，得回歸方程為：A=0.0658C+0.2469，r=0.9997。按文獻[8，9]，采用紫外-分光光度計，精密稱取葛根素25mg于50mL容量瓶中，加95%的乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。吸取1.0mL于25ml容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，取1.0mL乙醇同樣稀釋作空白對照，在250nm處測定吸收度由回歸方程計算出產品中葛根素的純度。
2.3.2紅外光譜鑒定
    紅外光譜采用島津IR-440型紅外光譜儀，KBr壓片法測定[10]，掃描波長500－4000cm－1。
2.3.3核磁氫譜（1H NMR）鑒定
    將葛根素提取物及其衍生物溶于氘代甲醇[11]（CD3OD-d4）中在Mercury 400MHz核磁共振儀上測定氫譜，以四甲基硅烷（TMS）為內標物。
3.結果與分析
3.1 葛根素提取物的收率和純度
    由2.1和2.3.1可得出葛根素的收率和純度分別為1.41%和97%。
3.2紅外光譜分析[10]
    葛根素提取物的IRυKBr Max（cm-1）：3398，1630，1584，1515，1443，1384，1257，1178，1118，1081，1041。與葛根素標準品的紅外數據基本一致：3370，1631，1607，1514，1447，1396,1273,1210，1103，1059，1008。
    3ˊ－亞甲基－六氫吡啶-葛根素的合成IRv max（KBr）cm－1： 1626、1280、1441、3375、1064、2929、1499、1550、1532、 2282、1709、1725。其中3250－3450間的寬帶（3375）是由氫鍵締合的羥基的伸縮振動引起；1709處的強吸收峰是分子中存在的C=O的明顯例證； 1626、1532、1550、1499、1441是苯環的骨架振動引起的典型吸收；1280、1064表明分子中存在C-O－C結構。
    3ˊ－亞甲基－四氫吡咯－葛根素的合成IRv max（KBr）cm－1：1123、3404、1625 1279、1441、1386、1550、1512、 615、 1531、798、1708、2282、1724、3717、23483250－3400或3404寬帶（－OH），1708（C=O），1625，1512，1550，1531， 1441，1386（苯環），1279，1123（C-O-C）。
3.3核磁氫譜（1H NMR）鑒定[11]
    葛根素提取物1HNMR（CD3OD-d4，400MHz，TMS內標）：δ:8.04(1H,d,J=9Hz;C5-H)，6.98(1H,d,J=9Hz;C6-H)，7.36(2H,d,J=9Hz;C2′,6′-H)，6.98(2H，d，=9Hz；C3′,5ˊ-H)，8.14(1H，s;C2-H), 5.09(1H,d,J=10Hz;C1?-H)。
    3ˊ－亞甲基－六氫吡啶-葛根素1H NMR（CD3OD-d4，400MHz，TMS內標）：δ：8.144（1H，s；C2-H），7.97（1H，d；C5-H），7.30（2H ，d，C2ˊ，6ˊ-H），6.91（1H，d，C6-H），6.81（1H，d，C5ˊ-H），5.07（1H，d，C1″-H），3.84（2H，s，Ar-CH2-），2.72（4H，s，－NCH2－），1.68（6H，t，－CH2CH2CH2-）。
    3ˊ－亞甲基－四氫吡咯－葛根素1H NMR（CD3OD-d4，400MHz，TMS內標）：δ：8.249（1H，s；C2-H），8.05（1H，d；C5-H），7.43（2H ，d，C2ˊ，6ˊ-H），6.98（1H，d，C6-H），6.95（1H，d，C5ˊ-H），5.07（1H，d，C1″-H），4.279（2H，s，Ar-CH2－），1.985（4H，t，－NCH2-），1.296（4H，t，－CH2CH2-）。
4.討論
    采用紫外分光廣度法對產品中葛根素的含量及純度進行了檢測，所得產品葛根素收得率為1.41%，純度為97%；潘娓婕等[8]利用酸水解法所得葛根素收得率為1.36%，純度為98.32%，而張尊聽等[9]分離所得葛根素產率為1.2%，純度為93.4%。對比發現葛根素收得率比上述兩者都高，純度略低于前者，因此該工藝可進行工業化試生產。
    由于大部分藥物的療效是由藥物分子與生物受體分子間的相互作用而產生，因此，藥物分子的溶解性能及分子的大小、形狀和空間結構都很重要。由此我們設想通過結構修飾來改善葛根素的水溶性和脂溶性，并改變其空間結構，從而影響葛根素的藥理活性。但目前對葛根素的結構修飾主要集中在酚羥基和糖C－6??醇羥基[12，13]，但反應過程中結合和屏蔽了葛根素的主要官能團－酚羥基，從而降低了物質本身的生物活性。本試驗利用Mannich反應在葛根素的4′－OH的鄰位引進了堿性基團，該基團可與酸結合生成鹽，由于鹽類物質易溶于水，因此可顯著改善葛根素水溶性差的缺點，同時避免了與其主要管能團－酚羥基發生反應。
    王昕[14]等對國內外文獻報道的近四十種葛根黃豆甙元結構改造產物進行了對比，利用分子藥理學理論，討論了其結構與抗缺氧及雌性激素作用的關系，對比研究發現，一般吸電子基團的取代對抗缺氧作用不利；邵國賢等[15]根據抗缺氧實驗觀察到一般吸電子基團的取代對抗缺氧作用不利，而供電子基團則有利于抗缺氧，推測可能是異黃酮的毗喃酮環上的氧原子的電子云密度與抗缺氧作用有關。葛根素是異黃酮類化合物，其生理活性與抗缺氧作用存在著極為密切的關系。據此推測本試驗合成的2種新化合物其3′或5′取代基都是供電子基團，故有利于抗缺氧作用，但是否具有比葛根素較強的藥理活性有待進一步研究。