動物基因工程

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  動物基因工程

一、遺傳工程的概念

遺傳工程（genetic engineering）是七十年代發(fā)展起來的一門新技術，它是綜合分子生物學與微生物學、分子遺傳學等理論和技術建立起來的。

1. 定義

廣義：基因工程、細胞工程、染色體工程和細胞器工程。

狹義：基因工程

●基因工程：是一種操作，它不是通過一般傳統(tǒng)的有性雜交方法，而是采取類似于工程建設的方式，按照預先設計的藍圖，借助于實驗室的技術，將某種生物的基因或基因組轉移到另一種生物中去，使后者定向地獲得新的遺傳性狀，成為新的類型。這實際上就是目前講的轉基因技術。

2. 基因工程的優(yōu)越性
傳統(tǒng)雜交只能進行親緣關系較近的交配（遠緣交配失敗），無法進行遠緣交配（即遺傳物質交流），遺傳物質交流開始是全方位的，通過人為選擇，可以達到目的性狀，但工作量大，且容易改變原來的其他優(yōu)良性狀。但基因工程就不同的，它不但可以進行種間、屬間科間遺傳物質交流，還可以進行高等、低等，動物與植物間遺傳物質交流，同時可以定向而不改變原來的優(yōu)良性狀，所以十分誘人！目前基因工程主要在以下幾方面應用：


a. 生物制藥

b. 遺傳病治療

c. 農業(yè)新品種選育

d. 發(fā)酵工程

e. 治理環(huán)境污染(創(chuàng)新微生物類型)

f. 其他
等

3. 基因工程施工的程序

a. 施工準備材料, 即“目的”基因，載體和工具酶等。

b. 把目的基因與載體結合成重組DNA分子


c. 把重組DNA分子引入受體細胞，即基因轉移，建立分子無性繁殖或稱克隆。
    d. 鑒定篩選轉基因系
  二、基因工程的四大要素及實施要點

（一）基因的克隆（分離）

1. 鳥槍法（shot gun）

2. 化學合成

3. 從cDNA庫中分離

●cDNA：反轉錄DNA

如果已知基因的特異mRNA，就可以直接利用該mRNA反轉錄cDNA（基因）。

值得提出cDNA與原來的基因組的基因序列可能不一樣，因為內含子不轉錄。

●cDNA文庫
某一時期等組織基因轉錄形成mRNA總體反轉錄成cDNA，這些cDNA總體就稱為cDNA文庫。

4. 從基因組文庫中分離

●基因組文庫：將基因組DNA通過限制性內切酶部分酶解后所產生的基因組DNA片段隨機地同相應的載體、重組、克隆，所產生的克隆群體代表基因組DNA的所有序列，現在已構建的基因組文庫主要有：

BAC(細菌人工染色體)，以細菌作為對象，將DNA片段與質粒重組后轉入細菌中繁殖。

YAC(酵母人工染色體)，以酵母作為對象。

PAC(噬菌體人工染色體), 以噬菌體作為對象。

TAC(可轉化的細菌人工染色體)

MAC(哺乳類人工染色體)

(二)重組DNA的建立

為了實現基因轉移，首先需要限制酶將“目的”基因安裝在一個特定的運載工具——載體DNA上，在載體DNA的運載和保護下，被轉移的基因可以通過適當方法順利進入受體細胞，在受體細胞中復制，擴增，最后整合到染色體上，達到穩(wěn)定表達。

1. 運載工具

●作為運載工具的條件

〇在宿主細胞中能自我復制，并能穩(wěn)定地保存有多種限制酶的切點，每種酶的切點最好只有一個，酶切后并不損壞其復制能力及選擇標志基因，并能嵌入外源DNA的片段。

〇具有可作為重組DNA分子選擇標記遺傳標記。

●原核生物載體的種類

現在有多種載體，它們分別由從細菌質粒、噬菌體DNA、病毒DNA分離出的元件組裝而成。

〇質粒載體：以細菌質粒（plasmid）的各種元件為基礎組建而成的基因工程載體。
質粒，環(huán)狀DNA大小1kbp到200kbp。

它們經改造后具有作為DNA運載工具所有的條件。

a. pBR322質粒，廣泛應用。


特征：

（a）有36個單一的限制性內切酶位點，（EcoRⅠ，HindⅢ等）

（b）四環(huán)素抗性基因Tetr。外源DNA片段插入到BamHI位點時，使Tetr失活，可以通過Ampr Tets來篩選重組體。

b. pUC18/19質粒


     c. pGEM系列多功能載體

●真核生物載體

真核生物載體與原核的不一樣。目前所用的大多是所謂的穿梭載體，它們應該具備如下條件：

〇含有原核基因的復制起始序列以及篩選標記

〇含有真核基因的復制起始序列以及真核細胞篩選標記

〇含有有效的啟動子序列

〇RNA聚合酶Ⅱ所需的轉錄終止和poly（A）加入的信號序列。
〇合適供外源基因插入的限制性內切酶位點。

舉列：yeast-E.coli穿梭載體

2. 限制性內切酶

細菌細胞對外來DNA具有防御，當DNA進入時，DNA會被一種特殊的酶（即限制性核酸內切酶）所毀滅，這個過程稱做限制。

這種限制性內切酶非常有用，它可以把大的DNA——小片段，也可以把運載工具—質粒切成適于攜帶基因或片段的狀態(tài)，以便形成重組DNA分子。這是一次巨大的發(fā)現。

●類別

第一群以EcoB、Ecok等為代表，能切斷雙鏈，切割部位沒有特異性。

第二群以EcoR1，HindⅢ（嗜血桿菌）等為代表，能切斷雙鏈，切割部位在DNA分子上有特定的堿基順序，即切割部位具有特異性。


● EcoR1和HindⅢ的特點

〇只在一定核苷酸順序上起作用
  〇多數可以產生粘性末端，即在酶解時，DNA雙鏈不在同一地方斷開，因而產生的片段兩端都帶有數個堿基的單鏈尾巴，這兩個單鏈尾巴帶有互補的堿基配對順序，可以互相自動接合成為環(huán)狀DNA，因此稱為粘性末端。

3. 重組DNA分子的建立

有了“目的”基因、載體DNA、限制酶，下一步是DNA的體外重組，就是把“目的”基因牢牢地安裝在載體上，使它們共價連接。這就是DNA分子的重組。

DNA的重組主要是采用限制性內切酶法。
同一種限制酶切割不同來源的DNA所產生的DNA片段，雖然區(qū)段和大小不同，但單鏈末端（粘性末端）的順序和長短都一樣。因此，不同來源的DNA片段，可以通過粘性末端對應堿基間的氫鍵集合到一起，再經DNA連接酶的作用，將切口接合起來，成為一個完整的重組DNA分子（如下圖）。

（三）重組DNA的導入

重組DNA的導入方法有多種

1. 轉化或轉染

●轉化：以質粒為載體的重組DNA分子引入受體細胞。

●轉染：把重組噬菌體或重組病毒DNA引入受體細胞。

這二種方法導入重組DNA關鍵的問題是要有感受態(tài)的細胞，即處于最適于攝取外源DNA的生理狀態(tài)的細胞。目前創(chuàng)建感受態(tài)細菌的方法是讓受體菌經一定濃度的冰冷CaCL2（50~100mmo/L）溶液處理一段時間。   


2. 高壓電穿孔法，即基因槍的方法方便，但必須有專門儀器

3. PEG(聚乙二醇)介導的原生質體轉化法

4. 磷酸鈣或DEAE-葡聚糖介導的轉染

5. 原生質體融合（如下圖）  


6. 脂質體法

7. 細胞顯微注射法   
   
（四）基因重組體的篩選

1. 利用質粒上特異的篩選標記進行特異篩選

2. 分子雜交篩選

3. 其他的方法
三、細胞工程

1. 體細胞雜交

2. 細胞核移植