DNA疫苗在動(dòng)物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

kinki0396

摘要： DNA疫苗是繼減毒疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗和重組多肽疫苗之后的又一新型疫苗，比其它疫苗高效、安全且易于大量生產(chǎn)。本文對(duì)DNA疫苗在牛、豬和雞一些病毒病上的使用效果及其安全問(wèn)題等方面的研究近況作一綜述。
　　 關(guān)鍵詞： DNA疫苗；動(dòng)物醫(yī)學(xué)
　　 近年來(lái)，許多畜禽病毒性傳染病，已不能依靠傳統(tǒng)疫苗如滅活疫苗、弱毒疫苗等對(duì)其進(jìn)行防治，DNA疫苗的出現(xiàn)使得這一狀況得到改善。編碼病毒、細(xì)菌和寄生蟲(chóng)等不同種類(lèi)抗原基因的質(zhì)粒DNA，能夠引起脊椎動(dòng)物如哺乳類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)和魚(yú)類(lèi)等多個(gè)物種產(chǎn)生強(qiáng)烈而持久的免疫反應(yīng)。DNA疫苗被稱為繼滅活疫苗和弱毒疫苗、亞單位疫苗之后的“第三代疫苗”，具有廣闊的發(fā)展前景。
　　 1 DNA疫苗簡(jiǎn)介
　　 DNA疫苗又稱核酸疫苗或基因疫苗，是編碼免疫原或與免疫原相關(guān)的真核表達(dá)質(zhì)粒DNA(有時(shí)也可是RNA)，它可經(jīng)一定途徑進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，被宿主細(xì)胞攝取后轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)出抗原蛋白，此抗原蛋白能刺激機(jī)體產(chǎn)生非特異性和特異性2種免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而起到免疫保護(hù)作用。
　　 DNA疫苗具有許多優(yōu)點(diǎn)：①DNA接種載體(如質(zhì)粒)的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，提純質(zhì)粒DNA的工藝簡(jiǎn)便，因而生產(chǎn)成本較低，且適于大批量生產(chǎn)；②DNA分子克隆比較容易，使得DNA疫苗能根據(jù)需要隨時(shí)進(jìn)行更新；③DNA分子很穩(wěn)定，可制成DNA疫苗凍干苗，使用時(shí)在鹽溶液中可恢復(fù)原有活性，因而便于運(yùn)輸和保存；④比傳統(tǒng)疫苗安全，雖然DNA疫苗具有與弱毒疫苗相當(dāng)?shù)拿庖咴裕芗せ罴?xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞而誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，但由于DNA序列編碼的僅是單一的一段病毒基因，基本沒(méi)有毒性逆轉(zhuǎn)的可能，因此不存在減毒疫苗毒力回升的危險(xiǎn)(Davis等，1999)，而且由于機(jī)體免疫系統(tǒng)中DNA疫苗的抗原相關(guān)表位比較穩(wěn)定，因此DNA疫苗也不象弱毒疫苗或亞單位疫苗那樣，會(huì)出現(xiàn)表位丟失(Donnelly等，1999)；⑤質(zhì)粒本身可作為佐劑，因此使用DNA疫苗不用加佐劑，既降低成本又方便使用(Babiuk等，1999)；⑥將多種質(zhì)粒DNA簡(jiǎn)單混合，就可將生化特性類(lèi)似的抗原(如來(lái)源于相同病原菌的不同菌株)或1種病原體的多種不同抗原結(jié)合在一起，組成多價(jià)疫苗，從而使1種DNA疫苗能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)多個(gè)抗原表位的免疫保護(hù)作用，使DNA疫苗生產(chǎn)的靈活性大大增加。
　　 2 DNA疫苗的應(yīng)用
　　 2.1 豬
　　 2.1.1 偽狂犬病病毒(PRV) 將編碼PRVgC或gD基因的質(zhì)粒DNA免疫豬，能誘導(dǎo)保護(hù)性抗體的生成和細(xì)胞免疫的產(chǎn)生；將編碼gB、gC、gD的多種質(zhì)粒DNA混合使用，對(duì)引導(dǎo)免疫反應(yīng)更有效(Gerdts V等，1997；Rooij E M等，1998)。
　　 2.1.2 豬流感病毒(HIV) Mackling等(1998)的試驗(yàn)結(jié)果表明，編碼HIV1株的血凝素(HA)和核衣殼蛋白(NP)質(zhì)粒DNA用金顆粒包裹，以基因槍轟擊豬的表皮進(jìn)行免疫后，HA質(zhì)粒DNA能使豬產(chǎn)生粘膜免疫反應(yīng)而對(duì)流感病毒的攻擊具有抵抗力，DNA疫苗引起的免疫反應(yīng)與滅活疫苗相當(dāng)。
　　 2.1.3 豬呼吸與繁殖綜合征病毒(PRRS) PRRS基因片段ORF5編碼的主要囊膜糖蛋白GP5是該病毒的3個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白之一。含有ORF5基因質(zhì)粒DNA能誘導(dǎo)豬抗GP5特異性中和抗體的產(chǎn)生；且免疫豬的外周血單核細(xì)胞在GP5重組蛋白存在時(shí)能夠發(fā)生轉(zhuǎn)化反應(yīng)，顯示了GP5特異性細(xì)胞免疫的產(chǎn)生(Pirzadeh B等，1998)。Meng(2000)將GP5基因克隆入巨細(xì)胞病毒(CMV)早期啟動(dòng)子的控制之下構(gòu)建成真核表達(dá)質(zhì)粒而制備出DNA疫苗，用其免疫仔豬后可誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生，實(shí)驗(yàn)室攻毒后顯示出良好的保護(hù)效果。
　　 2.1.4 口蹄疫病毒(FMDV) 將FMDV全長(zhǎng)基因組的cDNA克隆到質(zhì)粒，并去除其編碼核衣殼蛋白VP1的細(xì)胞結(jié)合部位的DNA序列，構(gòu)建成質(zhì)粒DNA以肌肉或皮內(nèi)注射，初次免疫后2～4周，可使所有的豬都產(chǎn)生特異的病毒中和抗體，攻毒試驗(yàn)中呈現(xiàn)部分保護(hù)作用(Ward G等，1997)。
　　 2.1.5 豬瘟病毒(CSFV) 余興龍等(2000)構(gòu)建了CSFV主要保護(hù)性抗原E2基因4種不同的真核表達(dá)質(zhì)粒。小鼠免疫試驗(yàn)結(jié)果表明，E2基因上不同的功能區(qū)對(duì)基因疫苗的免疫應(yīng)答有很大影響，有信號(hào)肽序列的E2基因可誘導(dǎo)特異性的免疫反應(yīng)，且無(wú)跨膜區(qū)序列的E2基因所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)比有跨膜區(qū)序列的強(qiáng)，而無(wú)信號(hào)肽序列的E2基因所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)比有跨膜區(qū)序列的強(qiáng)，而無(wú)信號(hào)肽序列的E2基因則不能誘導(dǎo)產(chǎn)生CFSV特異性的免疫反應(yīng)。攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明，免疫家兔最少可抵抗10個(gè)最小感染劑量(MID)的豬瘟兔化弱毒苗(HCIV)的攻擊；免疫豬可抵抗致死劑量的CFSV石門(mén)株強(qiáng)毒的攻擊。
　　 2.2 牛
　　 2.2.1 牛呼吸道合胞體病毒(BRSV) 用BRSV G基因構(gòu)建的DNA疫苗，以無(wú)針?lè)绞矫庖咝∨r(shí)比皮內(nèi)或肌肉注射引起的免疫反應(yīng)強(qiáng)烈。
　　 2.2.2 牛皰疹病毒(BHV) 用表達(dá)BHV?1 gD基因的質(zhì)粒DNA疫苗免疫牛，能產(chǎn)生很高的中和抗體；攻毒試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，免疫組比非免疫組的病毒排放量明顯減少(schrijver R S等，1997)。此疫苗通過(guò)肌肉或皮內(nèi)注射均可引導(dǎo)免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。但皮內(nèi)注射引起的免疫反應(yīng)更強(qiáng)(孟松樹(shù)等，2000)。?
　　 2.2.3 牛病毒性腹瀉病毒(BVDV) 以表達(dá)BVDV1型主要糖蛋白E2的質(zhì)粒DNA肌肉注射小牛，可產(chǎn)生病毒中和抗體和抗原特異的細(xì)胞增殖反應(yīng)；免疫后16周進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)免疫牛能產(chǎn)生針對(duì)BVDV1型和2型的血清中和抗體強(qiáng)烈的記憶抗體反應(yīng)，對(duì)牛有部分免疫保護(hù)作用(Cox G J等，1993)。?
　　 2.3 雞
　　 2.3.1 新城疫病毒(DNV) Sakaguchi等(1996)將NDV F基因插入質(zhì)粒載體，F(xiàn)基因的表達(dá)受巨細(xì)胞病毒早期增強(qiáng)子和雞β?肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子控制。1周齡試驗(yàn)雞肌肉內(nèi)注射重組質(zhì)粒后，有2/5注射線性質(zhì)粒的雞和4/5注射線性質(zhì)粒與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑混合物的雞產(chǎn)生了高水平針對(duì)F蛋白的抗體，而注射閉環(huán)狀質(zhì)粒的雞不能產(chǎn)生抗體。免疫9周后，體內(nèi)有抗體的試驗(yàn)雞都能抵抗致死劑量NDV強(qiáng)毒的攻擊。?
　　 2.3.2 雞傳染性喉氣管炎病毒(ILT) 將分別構(gòu)建的含有雞傳染性喉氣管炎病毒王崗株gB、gC和gD基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒及空載體質(zhì)粒分組注射雛雞，攻毒后觀察免疫保護(hù)效果。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒誘導(dǎo)了免疫應(yīng)答，免疫保護(hù)率達(dá)到79%，該基因疫苗可以作為預(yù)防ILV的1個(gè)補(bǔ)充。?
　　 2.3.3 禽流感病毒 Robinson等(1993)最先將DNA疫苗用于雞，以編碼禽流感病毒H7N7株血凝素(HA)基因的質(zhì)粒(DNA)由不同途徑(靜脈、腹腔、皮下注射)免疫3周齡雞，可對(duì)致死劑量的H7N7株病毒鼻內(nèi)攻擊產(chǎn)生50%的保護(hù)。Fyna等(1993)為了研究DNA疫苗對(duì)雞最有效的免疫途徑，將100～200 μg編碼H7?HA的質(zhì)粒DNA通過(guò)靜脈、肌肉、皮下注射、點(diǎn)眼、囊內(nèi)、滴鼻等方式免疫3周齡雞。4周后進(jìn)行第2次免疫。第6周，用致死劑量的H7N7攻擊，免疫雞的存活率達(dá)10%～63%，而對(duì)照組的存活率只有2%。其中，多種途徑如靜脈和肌肉注射共同免疫的效果，比單一途徑如肌肉注射、點(diǎn)眼、法氏囊內(nèi)、滴鼻免疫效果好。Kodihalli等(1997)將編碼H5?HA的質(zhì)粒DNA以0.25、0.5、1.5或10 μg用基因槍免疫雞，4周后以100LD?50的Ty/lre/83株鼻內(nèi)免疫進(jìn)行攻擊，低至0.25 μg劑量的DNA可使50%的免疫雞存活。而1、5、10 μg的劑量可完全抵抗致死劑量病毒的攻擊。DNA疫苗對(duì)致死劑量的抗原變異株也可提供95%的保護(hù)，證實(shí)DNA流感疫苗具有廣闊的發(fā)展前景。
　　 國(guó)內(nèi)研制的H7亞型血凝素基因DNA疫苗，在極小的使用劑量下即可成功誘導(dǎo)免疫保護(hù)反應(yīng)，并有效阻斷同源低致病力禽流感病毒在機(jī)體內(nèi)的感染和排毒；研制的H5亞型血凝素DNA疫苗，具有良好的免疫原性，肌肉注射途徑即可獲得對(duì)同源強(qiáng)毒攻擊的免疫保護(hù)，并能有效阻斷免疫保護(hù)存活雞機(jī)體的排毒。
　　 3 DNA疫苗的安全性 雖然人們對(duì)于使用DNA疫苗的安全性存有疑慮，擔(dān)心DNA可能會(huì)整合到宿主細(xì)胞的染色體上而造成插入突變，但眾多研究結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)有插入突變的現(xiàn)象。質(zhì)粒DNA在動(dòng)物體內(nèi)會(huì)緩慢降解，不會(huì)造成動(dòng)物的自體免疫(陳化蘭等，1998)，也不隨卵子和精子傳入子代體內(nèi)，它隨生物鏈進(jìn)入其他物種體內(nèi)時(shí)也會(huì)失活，而且對(duì)環(huán)境的污染很小，因此其危險(xiǎn)性遠(yuǎn)低于現(xiàn)用疫苗。
　　 4 結(jié)語(yǔ)
　　 雖然近幾年來(lái)鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳類(lèi)動(dòng)物DNA疫苗的制作技術(shù)已趨成熟，但對(duì)于DNA疫苗的作用機(jī)制和各種病原體抗原基因的分離也有待于進(jìn)一步的探索。可以肯定，未來(lái)更多的高效安全、使用方便的DNA疫苗的制備和大規(guī)模生產(chǎn)，必將能促進(jìn)我國(guó)畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。




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