應用PCR技術診斷豬圓環病毒2型與豬偽狂犬病病毒混合感染＿＿＿陳義祥等

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發表于 2007-8-1 09:05:21 | 只看該作者回帖獎勵

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豬圓環病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV-2）是從豬斷奶后多系統衰竭綜合征（Post?weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS）病豬中分離的豬圓環病毒，又稱PMWS相關PCV。一般由PCV-2單獨引起的疾病比較輕微，但常常由于并發或繼發細菌或病毒感染而使死亡率大大增加，病死率可達25%以上。PCV-2感染和引起的疾病已呈全球分布，已成為危害養豬生產的主要疾病之一。我國北京、上海、江蘇等地都已證實有該病毒的存在，PCV-2具有免疫抑制特性，PCV-2感染可以引起繼發性免疫缺陷，發病或感染豬至少有短暫的免疫抑制現象而不能激發對其他病原體的有效免疫應答。豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）又稱豬皰疹病毒Ⅰ型，可引起家畜和某些野生動物的傳染病，其中對豬的危害最大，主要特征是發熱和腦脊髓炎，新生仔豬出現神經癥狀，成年豬多為隱性感染，妊娠母豬表現為流產、死胎、木乃伊，尤其是以產死胎較為嚴重，目前已有40多個國家報道發生本病，每年給世界養豬業造成巨大的損失，PRV已在我國廣泛存在。目前，關于PCV-2和PRV病原學常規檢測方法常常存在特異性、敏感性差、操作技術復雜、費時費力等缺點。PCR方法具有快速、特異、敏感的特點，已廣泛用于許多病毒和細菌病的快速診斷，PCV -2和PRV的分子生物學方面的研究已取得了很大的進展。本試驗在結合流行病學、臨床癥狀、病理剖檢的基礎上，應用PCR技術將桂林市和貴港市兩地送檢的病料，快速、準確地診斷為PCV-2和PRV的混合感染。?
1 材料與方法
1．1 病料處理 5月22日與8月10日，從廣西自治區桂林市和貴港市兩大規模化豬場無菌采取發病豬的脾臟、淋巴結、腦，-20℃保存。?
1．2 主要試劑 SDS購自AMRESCO、Tris 飽和酚購自TBD.BIO；氯仿、無水乙醇購自上海；dNTPs、TaqDNA聚合酶購自MBI公司；DL2000 DNA Marker、蛋白酶K購自TaKaRa公司。?
1．3 引物合成參考蘆銀華根據PCV-2全基因序列設計引物，C1：5′-?CCG CGG GCT GGC TGA ACT T-3′； C2：5′-ACC CCC GCC ACC GCT ACC-3′預期擴增的片段長度為1154 bp。參考中華人民共和國豬偽狂犬病診斷技術標準，引物序列為：PR1：5′-?CAG GAG GAC GAG CTG GGG CT-3′； PR2：5′-?GTC CAC GCC CCG CTT GAA GCT-3′，擴增豬偽狂犬病病毒基因中434~651堿基對（bp）之間217 bp片段。以上兩對引物均由大連寶生物公司合成。
1．4 病料中總DNA的抽提分別取病豬脾臟、淋巴結及腦，用研磨器充分研磨，用Hank's液1∶5稀釋，反復凍融3次以上，8 000 r/min離心10 min，取上清500 μl，加30 μl 10% SDS和10 μl 20 mg/ml蛋白酶K，50℃水浴搖床上放置2 h。加入等量的飽和酚，12 000 r/min離心?5 min?。取上清液，加入等量的酚∶氯仿（1∶1），渦旋20 s，12 000 r/min離心?5 min。取上清液，加入等量的氯仿，振蕩混勻，?12 000 r/min? 離心5 min。取上清液，加入2倍體積的無水乙醇和1/10上清液體積的3 M NaAc(pH?5.2?)，使其混勻。-20℃放置60 min，12 000 r/min離心10 min，棄上清，用75%無水乙醇沖洗沉淀2次，晾干，加入20 μl雙蒸水溶解即為模板。?
1．5 PCV?2目的基因片段的擴增 PCR反應體系：10×PCR buffer 5.0 μl，dNTP(2.5 m
mol/L) 4.0 μl，MgCl?2(25 mmol/L) 3.0 μl，上下游引物(25 pmol/μl)各1.0 μl，cDNA 5.0 μl，TaqDNA聚合酶(5 U/μl) 0.5 μl，加H?2O至50 μl。預變性94℃ 10 min進入循環，94℃ 1 min，53℃ 1 min, 72℃ 1.5 min，35個循環后72℃延伸5 min。反應結束后取5 μl PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，在凝膠成像系統上觀察目的片段。
1．6 PRV目的基因片段的擴增 PCR反應體系：10×PCR buffer 2.5 μl，dNTPs(2.5 mmol/L)2.0 μl，MgCl?2(25 mmol/L) 2.0 μl，PR1和PR2(25 pmol/μl)各0.5 μL，cDNA 4.0 μl，0.25 μl TaqDNA聚合酶(5 U/μl)，加H?2O至25 μl。預變性94℃ 3 min進入循環，94℃ 1 min，65℃ 1 min,72℃ 1 min, 40個循環后72℃延伸5 min。反應結束后取5 μl PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，在凝膠成像系統上觀察目的片段。
2 結果 ?
2．1 PCV-2的檢測結果應用PCR技術，利用合成的PCV?2特異性引物，從兩頭病豬的
脾、淋巴結混合病料中均擴增出長度為1 154 bp的特異目的基因片段，與陽性對照擴增的片段大小一致（圖1）。
圖1 PCV?2目的基因PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖
1.桂林病料；2.貴港病料；3.標準PCV?2；4.DL2000 DNA Marker
2．2 PRV的PCR檢測結果應用PCR技術，利用診斷PRV特異性引物，分別從病豬的腦組織中擴增出了長度約217 bp目的基因片段，與預期的結果一致，表明所檢測的病料為PRV陽性。PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果（圖2）。
圖2 PRV目的基因PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖
1.桂林病料；2.貴港病料；3.標準PCV；4.DL2000 DNA Marker
3 討論 ?
3.1 近年來，關于PCV?2和PRV的診斷方法有病毒分離鑒定、ELISA以及IFA等常規技術，隨著分子生物學技術的發展國內外已經建立了聚合酶鏈式反應（PCR）診斷技術，PCR技術用于診斷PCV?2和PRV具有：速度快、特異性強、敏感性高、穩定性好等特點，大大的提高了這兩種病毒病的檢出率和準確性，另外PCR技術對于PCV?2和PRV的早期感染、潛伏期感染和持續性感染的診斷均具有重要的意義。?
3．2 根據流行病學、臨床癥狀、病理剖檢的初步診斷，應用PCR技術，從廣西桂林某規模
豬場的病料中同時擴增出PCV-2和PRV特異的目的基因片段，從而確診為PCV?2和PRV混合感染。目前，本實驗室已經從廣西區的許多地市檢測并分離到PCV?2和PRV，而這次是從豬體內同時檢測到PCV-2和PRV的混合感染，可見疾病的發展情況日趨復雜，在疾病的預防和診斷過程中應引起重視。?
3．3 控制和消滅豬偽狂犬病所面臨的主要困難是偽狂犬病的潛伏感染問題，感染豬康復后往往會長期帶毒，且有散毒的危險，在機體受到體內外因素的剌激時，病毒往往被活化，并由帶毒動物傳給其他動物，引起疾病暴發。所以要控制本病的發生，只有做好免疫接種，完善飼養管理，嚴格防止病毒傳入健康豬群，尤其是引進種豬時必須經檢驗無病后才能引進。
3．4 根據近年來歐美各國在控制PMWS的經驗表明，對PCV-2感染的特異性控制措施很難奏效，目前，還沒有有效的疫苗可以用來預防PCV-2的感染。因此，只有通過對豬群加強飼養管理，提高營養水平，降低應激因素，完善用藥方案，防止繼發性感染，作好其他疾病的免疫接種等措施來預防和控制PCV-2的感染。?

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