豆類絲核菌次級代謝產物對動植物細胞損害作用的對比

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豆類絲核菌次級代謝產物對動植物細胞損害作用的對比 楊鳴琦*，張 黎，顏水泉 (西北農林科技大學動物科技學院，陜西楊凌712100)

[摘 要]為了探索豆類絲核菌或其次級代謝產物的動植物損害在細胞生物學上的關系，為苦馬豆素（swainsonine, SW）的毒理學研究提供新的研究思路。本試驗通過制作豆類絲核菌次級代謝產物污染的飼料和人工污染豆類絲核菌飼料，飼喂家兔17d ,剖檢家兔并取其腦、肝臟、腎臟等組織分別進行病理組織學和電鏡觀察；同時將不同濃度的次級代謝產物和不同株的豆類絲核菌分別污染回接的綠豆，待84h培養后，分別進行組織學和電鏡觀察。結果在對動植物細胞損害作用中，豆類絲核菌次級代謝產物使家兔腦組織和淋巴細胞空泡變性，神經細胞核糖體脫顆粒，粗面內質網擴張等；同時能使植物根部組織結構受損，細胞空泡變性，內膜破裂等。由此表明，豆類絲核菌引起的動物中毒作用主要是其次級代謝產物中SW發揮毒性，且同瘋草中毒引起的病理變化基本一致；菌株對植物根部的致病性與其次級代謝產物中SW含量呈正相關。即推測，SW很有可能不僅是動物豆類絲核菌中毒的主要毒素，而且是豆科植物絲核菌病中細胞損害的主要化學物質。 [關鍵詞]豆類絲核菌；次級代謝產物；苦馬豆素；毒性 [中圖分類號]：S859.8[文獻識別碼]A     動物的瘋草中毒研究目前報道較多，而且認為瘋草中毒的主要毒物是苦馬豆素（swainsonine,SW）[1～3]。SW同時也被認為是豆類絲核菌污染飼料引起流涎征的主要成分[4, 5]。楊鳴琦等首次在國內分離出的豆類絲核菌，與國外報道的該菌生理、形態特性相一致，也同時發現了該菌的植物致病性和所提取的SW的抗腫瘤作用[6,7]。進一步研究發現該菌的次級代謝產物中含有大量的SW[8]。但是，運用國內分離菌污染飼料是否同樣可引起動物中毒；中毒是菌體本身作用還是該菌的次級代謝產物作用；該菌的植物致病作用是否也同其次級代謝產物和SW相關；動物中毒與植物致病在細胞生物學角度上是否存在一定的關系，這些疑問目前仍未解決。因此，本試驗目的在于運用病理學方法分析豆類絲核菌次級代謝產物對動植物細胞的損害作用，并將動物中毒與植物致病作用進行比較，找到這兩個作用與次級代謝產物及SW的關系。其意義在于，該試驗對豆類絲核菌的毒性研究更加深入，并對豆類絲核菌引起動植物的毒害作用機理提供重要依據。 1材料與方法 1.1 主要儀器AO組織切片機：WARNER-LAMBERT TECH.INC，美國。JEM-100SX透射電子顯微鏡：日本JEOL公司制造。 XSZ-G型光學顯微鏡，重慶光學儀器廠制造。 Coolpix995型數碼相機，日本NIKON公司制造。ZPQ-280B智能氣候培養箱：哈爾濱東拓科技開發有限公司制造。SW-CJ-IF型醫用潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司制造。1602MP8-1型電子天平（萬分之一）：德國SARTORIUS COTTINGEN公司制造。 1.2主要試劑及其配制 豆類絲核菌：菌株02-6B和94-2B，由西北農林科技大學動物病理學實驗室提供。次級代謝產物液Ⅰ：將豆類絲核菌 14d發酵液稀釋為內含SW 0.54mg/ml，煮沸滅菌，待用。次級代謝產物液Ⅱ：將豆類絲核菌 14d發酵液稀釋為內含SW 0.14mg/ml，煮沸滅菌，待用。 1.3實驗動物和植物 家兔：購于陜西楊凌周邊農村，體重500g左右，共9只，雄性。綠豆：購于陜西楊凌市場。 1.4動物分組     A組：飼喂次級代謝產物組，家兔3只，每天每只定時飼喂含有豆類絲核菌次級代謝產物飼料7g及胡蘿卜、白菜等（每天攝入SW約為14.5mg/Kg·b），飼喂17d。B組：絲核菌污染飼料組，家兔3只，每天每只定時飼喂人工污染豆類絲核菌飼料Ⅱ7g及胡蘿卜、白菜等，飼喂17d。C組：空白組，家兔3只，每天每只飼喂普通飼料7g及胡蘿卜、白菜等，喂17d。 1.5實驗用綠豆與分組 Ⅰ組：空白對照組，將綠豆回接于少氮半固體培養基中培養[3]，共4管。Ⅱ組：將綠豆回接于培養基的同時，在培養基中接種菌株02-6B，共4管。Ⅲ組：將綠豆回接于培養基的同時，在培養基中接種菌株94-2B，共4管。Ⅳ組：將綠豆回接于含有高濃度次級代謝產物的培養基中（含SW 270mg/L），進行培養，共4管。Ⅴ組：將綠豆回接于含有低濃度培養基中（含SW 70mg/L），進行培養，共4管。Ⅵ組：將綠豆回接于培養基中培養24h后，滴加次級代謝產物液高濃度0.4ml（含SW 72mg/L）后繼續培養。Ⅶ組：將綠豆回接于培養基中培養24h后，滴加低濃度次級代謝產物液0.4ml（含SW 18.67mg/L）后繼續培養。 1.6中毒家兔的組織學與電鏡觀察     將各組家兔于試驗的第17d后處死，取血液并涂片，瑞氏染色，于1000倍油鏡下觀察淋巴細胞。將小腦、大腦、心臟、脾臟、腎臟用10％中性甲醛固定，常規石蠟包埋，連續切片，片厚4μm光學顯微鏡觀察。取大腦、小腦及肝組織用2.5％戊二醛固定，制作超薄切片，片厚300?，通過透射電子顯微鏡觀察，并記錄。 1.7回接綠豆試驗及其組織學與電鏡觀察     在無菌條件下，將綠豆用0.1％HgCl2浸泡5min,無菌水沖洗6次，再將綠豆放于含有無菌水的滅菌平皿中，于25℃普通溫箱培養，每隔24h換水一次。于培養3d時將已發芽的綠豆分別接種于各組試管中，并在光照氣候箱內進行培養，培養條件如下：白天5：00～19：00（14h），25℃，4級光照度；夜間19：00～5：00（10h），20℃，無光照。共計培養48h；48h后按照白天5：00～19：00（14h），22℃，4級光照度；夜間19：00～5：00（10h），15℃，無光照。共計培養36h。將回接培養完畢后的各組豆苗進行大體觀察、照相；并將各組豆苗中病變部位取樣用FAA固定液抽氣固定，進行石蠟包埋，連續切片，片厚10μm，番紅－固綠染色，光學顯微鏡進行觀察，記錄。另取培養后豆苗病變組織用4％戊二醛抽氣固定，制作超薄切片，片厚600?，用透射電子顯微鏡觀察，并記錄。 2結果 2.1家兔中毒試驗結果     家兔病變組織光學顯微鏡觀察,A、B兩組家兔，經17d培養后，血涂片中淋巴細胞均出現輕度空泡變性，C組血涂片中未見異常。A、B兩組小腦浦肯野氏細胞空泡變性，并出現衛星化及噬神經現象；大腦有個別神經細胞出現核濃縮、衛星化現象，并有小膠質細胞及神經細胞的空泡變性（見照片1）；毛細血管周圍水腫；腎間質瘀血，腎小管顆粒變性；肝臟瘀血，顆粒變性，個別動物出現脂肪變性；此外，心肌顆粒變性及膽管增生，并以第A組更為明顯。     家兔病變細胞電鏡觀察,A組腦組織中神經細胞皺縮，密度增大，個別神經細胞腫脹，內質網擴張，核糖體脫顆粒（見照片2），腦組織血管內皮水腫；B組中腦組織除以上情況外，還可見吞噬細胞溶酶體增多，出現噬神經現象。A、B兩組肝組織竇內出現嗜中性粒細胞，毛細膽管擴張，肝細胞線粒體散在存在，且糖原增多，肝臟枯否氏細胞溶酶體增多。 2.2回接綠豆試驗結果     大體觀察，Ⅱ～Ⅶ組豆苗中根部均有不同程度出現褐斑、萎縮，其中Ⅳ組豆苗生長完全抑制，根部只有主根無須根，且主根萎縮，潰爛，顏色變褐。除Ⅳ組外，在褐斑等病變程度上Ⅱ、Ⅵ組病變程度較Ⅲ組和Ⅴ組嚴重，而Ⅶ組病變程度最輕，幾乎無病變與Ⅰ組（對照組）情況接近。     光學顯微鏡觀察，Ⅱ～Ⅶ組豆苗根部橫斷切片中表現為疏導組織、導管或篩管中有侵填體產生，部分出現細胞結構破損，細胞壞死。在病變程度上Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ三組侵填體產生較多，維管束病變程度大，細胞壞死數量多，而Ⅲ、Ⅴ組相對病變程度較輕；Ⅶ組病變程度最輕，與大體觀察結果相一致。     透射電鏡觀察，Ⅱ～Ⅶ組根部細胞多表現為空泡變性，細胞壞死，細胞結構消失，由此細胞的細胞壁破裂或線粒體游走并進入液泡中（見照片3）。而Ⅳ組則表現為廣泛的細胞壞死（見照片4）。Ⅵ組還表現出細胞內膜破裂，葉綠體固縮、顏色加深及葉綠體空泡變性。 3討論 3.1豆類絲核菌次級代謝產物對家兔的毒性作用     在本次試驗中，經飼喂含有豆類絲核菌（A組）或其次級代謝產物（B組）的飼料17d，均未出現臨床癥狀，但經病理組織學及電鏡觀察，家兔的腦、肝、腎、血都有不同程度的細胞病變，而淋巴細胞、小腦浦肯野氏細胞及大腦的小膠質細胞與神經細胞的空泡變性，則與家畜瘋草中毒的病理學變化相同，而且表明該次級代謝產物或真菌的中毒主要是由SW引起的，并且再一次表明SW引起的動物中毒具有一定的貯積作用，屬于慢性中毒，并與國外在瘋草中研究SW的中毒表現是一致的[3]。而A、B兩組雖然A組為直接運用含SW的次級代謝產物，B組為人工污染豆類絲核菌，但在家兔中毒中病理學變化來看是基本一致的，它不但表明該菌污染飼料和國外報道的[9～11]豆類絲核菌引起動物的中毒相似，而且還表明豆類絲核菌污染引起動物中毒主要是由其產生的次級代謝產物所引起的。此外，在病理組織學變化中腦組織毛細血管水腫，腎小管顆粒變性，心肌顆粒變性及肝臟瘀血、顆粒變性等則同樣與文獻[12～14]中家兔、羊、小鼠的瘋草中毒表現相似，也同樣表明SW除了對以腦組織為主的神經系統進行損害外，還能對心、肝、腎等重要器官的組織細胞進行損害。     結合電鏡觀察結果，神經細胞的皺縮、細胞密度增大及組織學和電鏡中均觀察到的噬神經現象表明，該次級代謝產物的神經毒害作用，可導致神經細胞的壞死。粗面內質網是細胞體內的重要的蛋白質合成器官，上面附著的核糖體則主要產生分泌型蛋白質及膜表面的功能及構型蛋白質，而神經細胞的內質網擴張及核糖體的脫顆粒，則表明這些神經細胞的損傷與壞死與其蛋白質合成代謝障礙有關，特別是膜表面的蛋白質合成受到影響，而膜表面蛋白除了起到結構蛋白的作用外，還是多種離子與營養物質運輸的通道，因此推測含有SW的次級代謝產物可使整個神經細胞的營養代謝造成紊亂。此外，在電鏡觀察中還發現吞噬細胞內溶酶體的增多，這可能與SW的α-甘露糖苷酶抑制作用有關，從而導致部分合成的低聚糖及糖蛋白在溶酶體內的聚積，即導致機體的溶酶貯積病。腦中毛細血管周圍的水腫則表明腦組織中低聚糖增加，引起了組織滲透平衡紊亂。同時，SW還可能發揮有影響機體能量代謝的作用，即表現在肝細胞的線粒體減少而糖元的增多上。     由此可見，豆類絲核菌引起的動物中毒作用主要是其次級代謝產物發揮毒性，而其中主要以SW的作用為主，并且同瘋草中毒引起的病理變化基本一致。而SW在中毒中發揮的作用不但影響了機體中其靶細胞的物質運輸，同時還影響細胞的能量代謝，從而導致細胞病變。 3.2豆類絲核菌次級代謝產物對綠豆苗的致病作用     從大體觀察看，無論是直接接種豆類絲核菌還是通過不同方式直接運用其產生的次級代謝產物，植物根部均能表現出褐斑及潰爛，而在高濃度次級代謝產物組（含SW 270mg/L）中豆苗的生長完全受到抑制。由此可以看出，該菌的植物致病作用和動物中毒相似仍然是次級代謝產物發揮主導作用。在組織學觀察中，Ⅱ～Ⅶ組中均有不同程度的維管束病變，植物的疏導組織、導管或篩管均有侵填體產生，并伴有部分細胞的破損、壞死，從而表明，該代謝產物導致植物的水分和營養物質運輸受阻。而在Ⅳ～Ⅶ組中，無論何種方式在培養基中添加次級代謝產物，隨著該次級代謝產物濃度的增加（SW濃度的增加），病變程度越重，侵填體越多。即表明該代謝產物在培養基中的濃度與病變程度呈正相關。除此以外，Ⅱ組植物根部的病變情況明顯比Ⅲ組嚴重，雖然都是接種豆類絲核菌，但菌株不同，病變程度也不盡相同（Ⅱ組為02-6B株，Ⅲ組為94-2B株），即表明02-6B菌株致病性比94－2B菌株致病性強，而由第三章中各菌株次級代謝產物中SW含量看，02-6B的SW含量同樣高于94-2B的含量，即表明菌株的致病性與其次級代謝產物中SW含量呈正相關。 3.3豆類絲核菌次級代謝產物對動植物細胞損害的對比     從動植物細胞的超微結構上來看，綠豆根部細胞病變同動物中毒后神經細胞病變一樣，出現空泡變性，即SW細胞損害作用的特征病變，并結合SW含量與植物致病性的正相關作用在本次試驗中的體現，推測該次級代謝產物的植物致病作用仍與其中的SW有關。而植物細胞的細胞壁與內膜的破裂則與動物中毒中所推測出的及文獻[15]報道的SW對動物細胞膜表面蛋白結構的損害作用有一定的相似性，即推測在植物中，可能仍是由于SW的作用導致甘露糖苷酶Ⅱ受到抑制，從而使膜表面蛋白及細胞骨架合成障礙，從而破壞其結構。而在植物中侵填體增加與動物細胞中糖元蓄積、粗面內質網擴張、脫顆粒等的作用結果均是營養物質運輸的受阻所致。在植物中重要的能量產生單位――葉綠體，在次級代謝產物的作用下出現了固縮、顏色加深及葉綠體內的空泡變性，這一病理變化是在沒有葉綠體的動物細胞中無法見到的。而在動物細胞中吞噬細胞溶酶體增多也是無法在沒有免疫吞噬細胞的植物中發現的。但有一點可以肯定，那就是該次級代謝產物對動植物細胞的總體作用均是阻斷了或抑制了細胞正常的物質運輸及能量代謝。雖然動物的SW中毒已基本確定為其甘露糖苷酶的抑制作用所引起的細胞代謝紊亂[16]，而在植物的致病中目前對此仍無報道，但是從豆類絲核菌次級代謝產物作用后細胞內超微結構的病變與動物細胞病變有一定的相似性上看，SW仍在植物致病中發揮作用且和在動物中毒中發揮作用相同，即推測，SW很有可能不僅是動物豆類絲核菌中毒的主要毒素，而且是豆科植物絲核菌病中細胞損害的主要化學物質。而要真正確定這一推論，并深入研究SW在動植物細胞中對代謝具體途徑的影響，以及該次級代謝產物中SW以外生物堿在動物中毒與植物致病中發揮的作用等一系列問題仍有待進一步研究。