甘肅棘豆抗腫瘤活性組分篩選試驗*

貔貅

柳軍璽1，吳達1，2,師彥平1 ，王建華2 （1中國科學院蘭州化學物理研究所，甘肅省天然藥物重點實驗室, 甘肅 蘭州 730000； 2西北農林科技大學動物科技學院，陜西 楊凌 712100)

摘要:以甘肅棘豆(Oxytropis Kansuensis)提取物的乙酸乙酯部位、水相部位,以及生物堿和非生物堿部位，對荷S180和H22腫瘤小鼠進行了體內抗腫瘤實驗。結果表明，被試驗的四個樣品中，非生物堿部位沒有抗腫瘤活性，乙酸乙酯部位和水相部位對S180和H22均具有一定的抑制作用，但作用都不及生物堿部位強；各試驗組小鼠的胸腺、脾臟和體重均無明顯變化,這也表明四種組分樣品在試驗用劑量時，對小鼠均無毒性反映。 關鍵詞:甘肅棘豆；S180；H22；抗腫瘤活性；活性篩選 The Screening of anti-tumor composition from Oxytropis kansuensis LIU Jun-Xi1, WU Da1,2, SHI Yan-Ping1Δ, WANG Jian-Hua2 (1Lanzhou Institue of Chemical Physics, CAS, Lanzhou 730000, China;2 College of AnimalScience and Veterinary Medicine, Northwest Sci.-Tech.University of Agriculture and Forestry, Shanxi Yangling 712100, China) AbstractScreening of the effective anti-tumor fractions from acetic ester fraction and water fraction as well as alkaloids fraction and non-alkaloids fraction of Oxytropis Kansuensis on mice bearing S180 and H22 in vivo. The results shown that the alkaloids fraction has obvious role on anti-tumor. To some extent, acetic ester fraction and water fraction also have effect on mice bearing S180 and H22 , but the effect of them are both inferior to that of alkaloid fraction. The weight analysis of immune organs and the gaining body-weight indicate that every treat has no toxic influence on mice and can not enhance the no-specific immune function of mice. Key wordsOxytropis Kansuensis；Sarcoma180；H22；anti-tumor effect；bioactive screening     甘肅棘豆(Oxytropis kansuensis) 是西北牧區危害最嚴重的毒草之一，目前其研究熱點是防除和綜合利用［1］。 近年來研究表明,甘肅棘豆及其同屬植物總提取物具有較強的抗腫瘤活性［2－4］，并認為甘肅棘豆抗腫瘤作用的主要活性與其所含的生物堿苦馬豆素有關。然而，苦馬豆素在棘豆中含量很低，從棘豆中提取苦馬豆素的技術尚不成熟，為此研究甘肅棘豆植物抗腫瘤的活性部位顯得尤為重要。     選取甘肅棘豆乙酸乙酯部位和水相部位以及生物堿、非生物堿部位對荷S180和H22腫瘤小鼠進行體內抗腫瘤活性篩選實驗。結果表明試驗選用的四個部位（乙酸乙酯極性部位、水相部位以及生物堿和非生物堿部位）中，生物堿部位抗腫瘤活性最強，非生物堿部位沒有抗腫瘤作用，其它兩個極性部位有一定的抗腫瘤活性，但作用都不及生物堿部位強。研究結果進一步表明生物堿部位為甘肅棘豆抗腫瘤的主要活性部位。 1 材料與方法 1.1動物及瘤株：     實驗動物選用昆明種小鼠，6～8周齡，體重20±2.0g，雌雄兼用，每批試驗采用統一性別，由甘肅省醫學科學研究院實驗動物中心提供，合格證號：醫動字第14-009號；實驗環境：溫度20～22℃，相對濕度45～50%，環境設施合格證：醫動字第14-019號；S180肉瘤購于中國醫科院藥物研究所。按常規方法，無菌條件下，選擇生長良好的S180肉瘤，制備成細胞懸液，調整細胞濃度為1.46×106/ml，于小鼠右前腋下接種0.2ml/只。接種次日，隨機將接種好的小鼠分成3組，每組為10只。抑瘤試驗重復三次。 1.2實驗用藥物 A（乙酸乙酯萃取部位）、B（水相部位）、C（生物堿部位）和D（非生物堿部位），由中國科學院蘭州化學物理研究所甘肅省天然藥物重點實驗室提供，參照預試驗及活性篩選給藥量，各樣品試驗用劑量分別為：A：0.25 g/kg、0.5 g/kg、1.0 g/kg；B：1.0 g/kg、3.0 g/kg；C：0.25 g/kg、0.5 g/kg、1.0 g/kg；D：1.0 g/kg、3.0 g/kg。蒸餾水陰性對照組和各樣品試驗組灌胃給予，接種24 h后開始給藥，給藥量0.2ml/10g體重；環磷酰胺（CTX）：中美合資山西泰盛制藥有限公司生產，批號：011121, 臨時用注射用水配成所需濃度（25mg/kg），腹腔注射給藥, 每日0.1ml/10g體重, 給藥10 d。 1.3實驗方法     所有動物每天給藥一次，連續10 d，并隔日稱體重一次，停藥次日脫頸處死小鼠，剖取瘤塊、胸腺及脾臟，并稱重，計算抑瘤率、胸腺系數、脾系數增長率及體增重率。試驗分批進行，各樣品各劑量均進行重復試驗。 腫瘤抑制率（%）=（1-給藥組平均瘤重/對照組平均瘤重）×100%； 胸腺（脾）重量系數（mg/10g）= 胸腺（脾）重量/去瘤重量×10； 胸腺（脾）重量系數增長率（%）= [給藥組胸腺（脾）重量系數/對照組胸腺（脾） 重量系數]×100； 動物增重= 去瘤體重- 起始體重； 動物體重增長率（%）= （給藥組增重- 對照組增重）/對照組增重×100。 固定好的瘤塊，切片后進行病理檢查（HE染色）。所有數據用SPSS10.0統計軟件中單因素方差分析進行統計分析。 2結果 2.1樣品對小鼠移植性腫瘤S180的作用     A、B、C對小鼠移植性腫瘤S180均有明顯的抑制作用，重復性較好，且統計學處理差異有顯著性（P<0.05-0.001）。A抑制率為35.85%～56.25%；B為39.84%～57.03%；C為34.38～64.06%。D對S180無明顯抑制作用，統計學處理差異無顯著性（P>0.05），抑制率為15.09～24.53%，見表1。 2.2樣品對小鼠移植性腫瘤H22的作用     A、B、C對小鼠移植性腫瘤H22均有一定的抑制作用，重復性較好，且統計學處理差異有顯著性（P<0.05-0.001）。A抑制率為20.35%～48.67%；B為38.05%～41.43%；C為43.57～58.57%。D對H22無明顯抑制作用，統計學處理差異無顯著性（P>0.05），抑制率為20.35～24.78%，見表2。 2.3樣品對荷S180、、H22小鼠的免疫器官的影響     A、B、C對荷S180、H22小鼠的胸腺、脾臟重量系數與對照組相比，經統計學處理，差異均無顯著性（P>0.05）。D1.0g/kg劑量時可提高荷S180小鼠的胸腺重量系數，增長率為24.63%，與對照組相比，經統計學處理差異有顯著性（P<0.05）。CTX胸腺、脾臟系數明顯降低（P<0.001）。 2.4樣品對荷S180、H22小鼠體重的影響     各樣品在不同劑量時對荷S180、H22雌雄小鼠的體重均有不同程度的影響。 2.5各組腫瘤切片病理檢查     蒸餾水陰性對照組小鼠腫瘤切片高倍鏡觀察: 腫瘤細胞呈團簇狀密集生長,排列緊實,核較大濃染,形態各異,異型性明顯，生物堿給藥組和環磷酰胺組可見大面積紅染無結構的壞死區，腫瘤細胞明顯減少，殘存腫瘤細胞大多萎縮，核深染固縮或碎裂迫向死亡，也可見個別逆轉腫瘤細胞，核明顯縮小，周圍胞漿紅染，核漿比例減小，呈規則的圓或橢圓型。組織間有炎性細胞浸潤；乙酸乙酯給藥組和水相部位給藥組腫瘤切片也可觀察到腫瘤細胞壞死。 3討論 3.1各樣品抑瘤作用分析     試驗用四個樣品中，非生物堿部位各劑量組每次試驗抑瘤率均小于30%，按抗腫瘤藥物體內篩選規程藥物療效評價標準，確認為沒有抗腫瘤活性；乙酸乙酯部位和水相部位對S180和H22均有一定抑制作用，但其抑制作用都不及生物堿部位強，這可能是由于抗癌活性生物堿在這兩個極性部位中不同程度分布的原因。因此，初步確定生物堿成分群是甘肅棘豆抗腫瘤的主要活性部位。 3.2各樣品對荷瘤小鼠免疫器官及體重的影響     本試驗按照《免疫動物篩選規程》中“免疫器官重量法”對荷瘤小鼠胸腺、脾臟進行了重量分析，結果表明各樣品對荷瘤小鼠胸腺、脾臟沒有明顯的影響；和對照組相比，體增重率也無統計意義。說明各樣品試驗用劑量對小鼠沒有毒性反映，也沒有提高荷瘤小鼠非特異性免疫功能。 3.3腫瘤病理切片觀察     腫瘤病理切片顯微鏡觀察可見，生物堿可使S180、H22惡性腫瘤細胞出現大面積壞死。這和已報道的研究結果相吻合，認為棘豆屬植物生物堿可直接殺傷腫瘤細胞。