HB-101壯健極品對中華鱉非特異性免疫功能和抗病力的影響

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HB-101壯健極品對中華鱉非特異性免疫功能和抗病力的影響

HB-101壯健極品對中華鱉 覃川杰(3) 徐 鎮(1) 肖志猛(1) 陳昌福(1，2) (1)華中農業大學水產學院，武漢 430070； (2)華中農業大學農業微生物學國家重點開放實驗室，武漢 430070 陳昌福 教授電話:027-87286037 chenchangfu@mail.hzau.edu.cn 　　摘要 本文報道HB-101壯健極品對中華鱉(Pelodiscus sinensis)幼鱉非特異性免疫功能和抗病力影響的研究結果。試驗共設6個組，在各組餌料中HB-101壯健極品的添加量依次為0 mg/kg(對照組)、10.0 mg/kg.B.W.(試驗I組)、20.0 mg/kg.B.W.(試驗Ⅱ)、30.0 mg/kg.B.W.(試驗Ⅲ組)、40.0 mg/kg.B.W.(試驗Ⅳ組)和50.0 mg/kg.B.W.(試驗V組)。投喂30 d后，從每組中各取10只中華鱉幼鱉采血，測定了中華鱉幼鱉血液中白細胞的吞噬活性、血清中溶菌酶和補體活性；另從每組分別取30只中華鱉幼鱉用注射嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)的方法行人工感染，檢測其抗病力。研究結果表明，各試驗組中華鱉幼鱉血液中白細胞的吞噬活性均顯著高于對照組(t測驗，P<0.05)。第Ⅰ和第Ⅱ組中華鱉幼鱉血清中溶菌酶活性與對照組之間沒有顯著性差異(t測驗，P>0.05)，而試驗Ⅲ、Ⅳ組和Ⅴ組中華鱉幼鱉血清中溶菌酶活性均顯著高于對照組(t測驗，P<0.05)。第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和第Ⅴ組中華鱉幼鱉血清中補體活性與對照組之間存在顯著差異(t測驗，P<0.05)，而第Ⅰ組與對照組之間無顯著性差異(t測驗，P>0.05)。投喂HB-101能增強中華鱉幼鱉對人工感染A. hydrophila活菌的抵抗力。研究結果證明在中華鱉幼鱉餌料中添加HB-101的量以20.0 mg/kg.B.W.左右為宜。 　　關鍵詞 中華鱉幼鱉；HB-101壯健極品；溶菌酶；補體；抗病力；嗜水氣單胞菌 　　作者等的初步研究結果已經證實，對中華鱉(Pelodiscus sinensis)投喂適量的HB-101壯健極品能增強其非特異性免疫功能[1]，說明HB-101壯健極品具有免疫刺激劑(immunostimulant)的特性，而且中華鱉的免疫系統同其它水產動物一樣能被免疫刺激劑激活[2~9]。但是，關于HB-101壯健極品所誘導的中華鱉非特異性免疫機能對其抗病力有無影響，尚不清楚。Robertsen等將從酵母菌中提取的β-葡聚糖給予大西洋鮭(Salmon salar)后，活菌攻毒結果證明供試魚對滅鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)和魯克耶爾森菌(Yersinia ruckeri)等致病菌感染的抵抗力顯著增強[4]。Anderson等用注射和浸泡法對溪紅點鱒(Salvelinus fontinalus)給予β-葡聚糖后，試驗魚對人工感染A. salmonicida 活菌的抵抗力也顯著增強[5]。Brattgjerd等對大西洋鮭注射酵母葡聚糖后，雖然發現試驗魚的巨噬細胞在離體條件下的吞噬活性和產生H2O2量有所上升，但是，攻毒試驗結果卻表明試驗和對照組魚體之間抗感染力沒有顯著差異[6]。Jeney等將葡聚糖作為佐劑與A.salmonicida滅活菌苗聯合使用，結果只是證明了能顯著提高供試虹鱒(Oncorhynchus mykiss)的部分非特異性免疫指標，而未對供試魚進行抗病力的測定[7]。 本研究利用武漢泰富產業有限公司生產的HB-101健壯極品定量投喂中華鱉幼鱉后，在測定幾種非特異性免疫指標變化的基礎上，采用活菌攻毒的方法檢測了供試中華鱉幼鱉的抗病力，現將結果報告如下。 1 材料和方法 1.1 供試中華鱉幼鱉和飼養條件 　　本研究中的中華鱉幼鱉飼養試驗在武漢多福科技農莊股份有限公司梁子湖特種水產苗種基地越冬溫室內飼養池中進行。在每個24.0 M2的水泥飼養池內飼養有平均體重63.0 g左右的600~650只中華鱉幼鱉，溫室內溫度變化在24℃~33℃之間，光照為人工光照和自然光照。每天上午9:00和下午6:00各投喂1次餌料，將餌料加少量水合成面團后投喂，投餌量以使中華鱉幼鱉達到飽食并有少量剩余為準。投餌4 h后，取出剩余餌料。所用餌料為武漢高龍餌料有限公司生產的全價幼鱉餌料，對照組所用餌料中除沒有添加HB-101之外，其它營養成分均沒有改變。 1.2 HB-101壯健極品 　　用于本研究的HB-101壯健極品是泰富生命工程(武漢)有限公司生產的粉劑。 1.3試驗設計 　　在全60個同規格的飼養池中隨機選取6個條件相同的飼養池作為試驗池。將試驗中華鱉幼鱉隨機分成6組。由于中華鱉幼鱉外觀上難以區分雌雄，因此，在本研究中不區分試驗中華鱉幼鱉的性別。各組餌料中HB-101壯健極品的添加量分別為0 mg/kg(對照組)、10.0 mg/kg.B.W.(試驗I組)、20.0 mg/kg.B.W.(試驗Ⅱ組)、30.0 mg/kg.B.W.(試驗Ⅲ組)、40.0 mg/kg.B.W.(試驗Ⅳ組)和50.0 mg/kg.B.W.(試驗Ⅴ組)。制作的餌料存放在陰涼處，每天喂食前4 h配制餌料。連續投喂30 d。 1.4 采血 　　在預定連續投喂30 d結束后的第2 d，從每個試驗和對照池中隨機撈取10只中華鱉幼鱉以斷頭法采血，將每只鱉的血液分為2份，其中1份以肝素抗凝，制備抗凝血供測定吞噬細胞的吞噬活性用；另1份血液置于4℃條件下離心制備血清，血清保存在-20℃冰箱中，以備下列指標的測定。 1.5解剖觀察及臟器測量 　　對采血后的中華鱉幼鱉進行解剖，肉眼觀察試驗與對照組中華鱉幼鱉臟器的異同，并對分離的器官和組織分別稱重和測量，用以比較試驗與對照組中華鱉幼鱉的機體指標(簡稱“體指”)異同。 1.6 吞噬原的制備 將金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)接種在液體肉湯培養基中，37℃下培養48 h后，離心集菌，在菌液中加入濃度為0.5%的福爾馬林，37℃下滅活24 h，用滅菌生理鹽水清洗3次，并將其濃度調整至1.0×108cells/mL，即為福爾馬林滅活的S. aureus菌體(formalin killed S.aureus, F-SA)，用作檢測血細胞吞噬活性的吞噬原。 1.7 血細胞吞噬活性的測定 　　在0.3 mL抗凝血中加入0.2 mL F-SA，搖勻，在25℃的恒溫水浴鍋中孵育45 min，每隔10 min搖動1次。用吸管吸取血細胞涂片，每個樣品涂5張，用甲醇固定10 min，Giemsa染色液染1 h，水洗風干后，鏡檢，并依下式計算白細胞吞噬百分比(phagocytic percentage，PP)和吞噬指數(phagocytic index，PI)。 吞噬百分比(PP) =(100個吞噬細胞中參與吞噬的細胞數/100)×100 吞噬指數(PI )= 細胞內總菌數/參與吞噬的細胞數 1.8 血清溶菌酶活性的測定 　　以溶壁微球菌(Micrococcus lysoleikticus)凍干粉為底物，將底物用0.1mol/L的pH為6.4的磷酸鉀鹽緩沖液配成一定濃度的懸液(O.D.570≈0.35~0.5)。取3.0 mL該懸液與0.05mL待測血清于試管中混勻，測其在570 nm處的光密度值(A0)，然后置于37℃水浴保溫30 min，取出后立刻置于冰浴中10.0 min以終止反應，測其在570 nm處的光密度值(A)。溶菌活力按下式計算：Uk=[(A0-A)/A]1/2 1.9 血清補體C3和C4活性的測定 　　采用伊利康生物技術有限公司生產的試劑盒，分別要求加入各試劑及血清后，在37℃水浴10 min，用透射比濁法在722型紫外分光光度計340 nm波長處讀取測定管和標準管的光密度值(A)，以計算補體C3和C4的活性。 1.10 抗病力檢測 　　將從患病中華鱉上分離的嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)BS-1菌株[10]接種在BHI(Difco)培養基中，28℃條件下培養36 h后，離心法集菌并以除菌生理鹽水調節菌液濃度至2.3×107cfu/mL備用。從各試驗和對照組中分別隨機撈取30只中華鱉幼鱉，經后肢窩對每只中華鱉幼鱉注射0.4 mL的A.hydrophila活菌液后，繼續飼養觀察21 d。對死亡的中華鱉幼鱉進行解剖并分離致病菌，以鼠抗A.hydrophila菌株血清與分離所得致病菌進行玻片凝集試驗，判斷是否由A.hydrophila感染致死。統計各組的死亡率，依下式計算相對保護率(Relative percent survival，RPS)。 相對保護率(RPS)= [1-(免疫組死亡率/對照組死亡率)]×100% 2 結果 2.1 HB-101健壯極品對中華鱉幼鱉各項體指的影響 　　對試驗和對照中華鱉幼鱉體重與各項體指的測量結果如表1所示。試驗期間對照和試驗組 表1 對照和試驗中華鱉幼鱉的增重量1) Table 1 Growth of control and experimental juvenile soft-shelled turtle(Pelodiscus sinensis) 1)10只供試中華鱉幼鱉的平均值，Mean value of 10 experimental juvenile soft-shelled turtle 　　中華鱉幼鱉的增重量、體重與內臟比和內臟與肝臟比，均無顯著性差異(t測驗，P>0.05)。此外，經過肉眼觀察，對照與試驗組中華鱉幼鱉的體形、內臟形態與顏色均未出現明顯差別。表明各種劑量的HB-101健壯極品，對中華鱉幼鱉的生長和機體各組織器官的正常生理機能沒有明顯不良影響。 2.2 白細胞吞噬活性的變化 　　供試中華鱉幼鱉血液中白細胞的PP和PI測定結果如表2所示。由表2可以看出投喂HB-101壯健極品的中華鱉血液中白細胞的PP和PI均高于對照組，PP和PI最高的是HB-101健壯極品投喂量為40.0 mg/kg.B.W.的第Ⅳ組。統計分析結果表明，試驗組中華鱉幼鱉血液中白細胞的PP和PI均顯著高于對照組(t測驗，P<0.05)，而各試驗組之間沒有顯著性差別(t測驗，P>0.05)。 表1 供試中華鱉幼鱉血液中白細胞的吞噬活性 Table 2 Phagocytic activity of leucocytes in the blood of juvenile soft-shelled turtle(Pelodiscus sinensis) 組別 吞噬活性 Phagocytic activity Groups PP PI Ⅰ 51.2±5.6 4.37±0.46 Ⅱ 48.5±6.1 4.69±0.53 Ⅲ 49.7±5.9 4.54±0.63 Ⅳ 50.4±4.8 5.03±0.66 Ⅴ 48.6±5.3 5.12±0.74 對照 Control 38.8±4.9 3.59±0.52 2.3 溶菌酶和補體活性的變化 　　供試中華鱉幼鱉血清中溶菌酶與補體活性的測定結果如表3所示。由表3可以看出投喂HB-101壯健極品的試驗組中華鱉幼鱉血清中的溶菌酶活性均高于對照組，溶菌酶活性最高的是HB-101壯健極品投喂量為40.0 mg/kg.B.W.的第Ⅵ組，其次是第Ⅴ組。統計分析結果表明，第Ⅲ組、第Ⅵ組和第Ⅴ組中華鱉幼鱉血清中溶菌酶活性與對照組之間存在顯著性差異(t測驗，P<0.05)；而第Ⅰ組和第Ⅱ組與對照組之間沒有顯著性差異(t測驗，P>0.05)。 供試中華鱉幼鱉血清中補體C3和C4的活性測定結果表明，投喂HB-101壯健極品的中華鱉幼鱉血清中補體C3活性均高于對照組，補體C3和C4活性最高的是投喂量為50.0 mg/kg.B.W.的第Ⅴ組，其次是投喂量為120.0mg/kg.B.W.的第Ⅳ組。統計分析結果表明，第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和第Ⅴ組中華鱉幼鱉血清中補體活性與對照組之間存在顯著差異(t測驗，P<0.05)，而第Ⅰ組與對照組之間無顯著性差異(t測驗，P>0.05)。 表3 供試中華鱉幼鱉血清中溶菌酶和補體C3、C4的活性 Table 3 Lysozyme and complement activity in the serum of juvenile soft-shelled turtle(Pelodiscus sinensis) 組別　　　　　　溶菌酶　　　　　　補體活性　　　　　　Complement activity Groups　　　　　　Lysozyme　　　　　C3　　　　　　　　　C4 Ⅰ　　　　　　　0.206±0.044　　　0.283±0.062　　　　0.299±0.065 Ⅱ　　　　　　　0.228±0.056　　　0.312±0.057　　　　0.314±0.065 Ⅲ　　　　　　　0.322±0.064　　　0.335±0.062　　　　0.348±0.053 Ⅳ　　　　　　　0.365±0.042　　　0.372±0.051　　　　0.366±0.072 Ⅴ　　　　　　　0.366±0.054　　　0.379±0.081　　　　0.372±0.049 對照 Control　　0.204±0.037　　　0.279±0.067　　　　0.293±0.039 2.4 人工接種致病菌后中華鱉幼鱉的存活率 　　對照和試驗組中華鱉幼鱉經活菌人工感染后，各組的死亡情況如表4所示。從表4 可以看 表4 活菌攻毒后中華鱉幼鱉的死亡率和相對保護率 Table 4 Mortality and relative percent survival(RPS)of juvenile soft-shelled turtle(Pelodiscus sinensis)，after challenged with live Aeromonas hydrophila 組別　　　　攻毒鱉只數　　　　死亡鱉只數　　　　死亡率　　　　相對保護率 　　　　　Number of fish　　Number of dead　　Mortality　　　Relative percent Groups 　　Challenged 　　　　　Fish　　　　　　　%　　　　　Survival(RPS)% Ⅰ　　　　　　30　　　　　　　　11　　　　　　　36.7　　　　　　60.6 Ⅱ　　　　　　30　　　　　　　　10　　　　　　　33.3　　　　　　64.3 Ⅲ　　　　　　30　　　　　　　　7 　　　　　　　23.3　　　　　　75.0 Ⅳ　　　　　　30　　　　　　　　8 　　　　　　　26.7　　　　　　71.4 Ⅴ　　　　　　30　　　　　　　　6 　　　　　　　20.0　　　　　　78.6 對照 Control　30　　　　　　　　28　　　　　　　93.3　 　　出經過投喂HB-101壯健極品1的中華鱉幼鱉均獲得了比較高的RPS，而在餌料中添加HB-101健壯極品 30.0 mg/kg.B.W.以上的第Ⅲ、第Ⅳ和第Ⅴ組中華鱉幼鱉死亡率明顯的低于添加量為10.0 mg/kg.B.W.和20.0 mg/kg.B.W.的第Ⅰ和第Ⅱ組。 3 討論 　　與其他動物一樣，中華鱉的非特異性免疫功能也包括體液免疫和細胞免疫部分[11]。在水產動物的細胞免疫中，血液中的白細胞的作用又是至關重要的[12]。魚類的嗜中性白細胞和單核細胞已經被證明具有很強的吞噬能力，這種能力對于特異性免疫機能相對于高等脊椎動物比較低等的動物而言，具有更為重要的意義[13]。白細胞的吞噬功能是動物非特異性免疫的重要組成部分。因此，通過測定血液中白細胞的吞噬功能，可以反映機體的非特異性細胞免疫狀態[14]。有研究結果證明了大西洋鮭的巨噬細胞上存在β-葡聚糖受體(receptor)，因此可以接受β-葡聚糖的刺激而增強其細胞的吞噬活性[15]。本研究的結果證明，在中華鱉幼鱉的餌料中添加HB-101壯健極品，能有效地增強白細胞的吞噬活性，說明這種物質對中華鱉幼鱉的免疫系統具有刺激作用。然而，關于這種物質究竟是作用于中華鱉幼鱉的何種免疫細胞而啟動細胞免疫過程的，尚有待進行更為深入的研究。 　　溶菌酶的活性是決定吞噬細胞對所吞噬的致病菌能否被殺滅的物質基礎之一[12]。因此，測定動物的溶菌酶活性，在一定程度上能反映動物非特異性體液免疫狀態。魚類血清中的溶菌酶活性可以因機體接觸抗原性物質或者受到環境因子的刺激而上升[12，16]。本研究結果證明了在中華鱉幼鱉餌料中添加HB-101能提高其血清中溶菌酶的活性，而且在10.0mg/kg.B.W.至50.0 mg/kg.B.W.的添加量范圍內，隨著HB-101健壯極品添加量的提高，供試中華鱉幼鱉血清中溶菌酶的活性也逐漸提高。由于本研究中采用的最高添加量為50.0 mg/kg.B.W.，所以，更高用量的HB-101健壯極品對中華鱉幼鱉的免疫機能是否也有抑制作用，值得進一步研究。 動物體內的補體主要是由肝細胞和巨噬細胞合成的，而血清中的補體主要是來自肝細胞[14]。本研究結果表明投喂HB-101健壯極品可以增強中華鱉幼鱉血清中補體C3和C4的活性，試驗組中華鱉幼鱉血清中補體C3和C4的活性均高于對照組。用A. hydrophila活菌對試驗和對照組中華鱉幼鱉人工感染試驗結果表明，口服給予HB-101健壯極品能提高中華鱉幼鱉對A. hydrophila活菌感染的RPS，并且其RPS的變化趨勢與中華鱉幼鱉血液中白細胞的吞噬活性、血清中溶菌酶、補體活性上升趨勢相一致，這種結果表明檢測中華鱉幼鱉血液中白細胞的吞噬活性、血清中溶菌酶、補體活性等指標，可以反映中華鱉幼鱉機體抗病力的狀況。 　　綜上所述，投喂適量的HB-101壯健極品對中華鱉幼鱉的非特異性免疫功能有明顯的促進作用，并且對中華鱉幼鱉的生長、機體形態和顏色均沒有不良影響。說明在餌料中添加適量的HB-101健壯極品能達到增強中華鱉幼鱉抗病力、預防傳染性疾病發生的效果。 參考文獻 1 陳昌福，姚 鵑，吳 凡等. 免疫多糖(酵母細胞壁)對中華鱉非特異性免疫功能的影響. 水生生物學報，2004，28(6)： 2 陳昌福，陳 萱，陳超然等. ?-葡聚糖的特性及其對動物免疫功能的調節. 華中農業大學學報，2003，22(1)：95~100 3 陳昌福，陳 萱，陳超然等. 水產甲殼動物的免疫防御機能及其免疫預防研究進展. 華中農業大學學報，2003，22(2)：197~203 4 Robertsen B, Rorstad G, Raa R. Enhancement of non-specific disease resistance in Atlantic salmon, Salmon salar L., by a glucan from Saccharomyces carevisiae cell wall. J Fish Dis, 1990, 13(5)：391~400 5 Anderson D P, Siwicki A K. Duration of protection against Aeromonas salmonicida in brook trout immunostimulated with glucan or chitosan by injection or immersion. The Prog Fish Cult, 1996, 56(3)：258~261 6 Brattgjerd S, Evensen O, Lauve A. Effect of injected yeast glucan on the activity of macrophages in Atlantic salmon, Salmo salar L., as evaluated by in vitro hydrogen peroxide production and phagocytic capacity. Immunology, 1994, 83(4)：288~294 7 Jeney G, Anderson D P. Glucan injection or bath exposure given alone or in combination with bacterin enhance the nonspecific defence mechanism in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture, 1993, (116)：315~329 8 Samuel M, Lam T J, Sin Y M. Effect of laminaran [β(1,3)-D-glucan] on the protective immunity of blue gourami, Trichogaster trichopterus against Aeromonas salmonicida. Fish & Shellfish Immunol, 1996, 6(4)：443~454 9 Engstad R E, Robertsen B. Specificity of a beta-glucan receptor on macrophages from Atlantic salmon (Salmo salar L.). Dev Comp Immunol, 1994, 18(4)：397~408 10 陳昌福，趙建培. 中華鱉白點病病原菌的分離與鑒定. 華中農業大學學報，1997，總第25期：101~107 11 楊先樂，周劍光，艾曉輝等. 中華鱉對T3菌苗抗原的免疫應答. 動物學報，2001，47(2)：163~169 12 Sakai M. Current research status of fish immunostimulants. Aquaculture，1999，(172)： 63~92 13 Samuel M, Lam T J, Sin Y M. Effect of laminaran [β(1,3)-D-glucan] on the protective immunity of blue gourami, Trichogaster trichopterus against Aeromonas salmonicida. Fish & Shellfish Immunol, 1996, 6(4)：443~454 14 大野尚仁. βグルカンの生體防御系修飾作用. 日本細菌學雜志，2000，55(3)：527~537 15 Engstad R E, Robertsen B. Specificity of a beta-glucan receptor on macrophages from Atlantic salmon (Salmo salar L.). Dev Comp Immunol, 1994, 18(4)：397~408 16 陳昌福，羅宇良，蔡 冰等. 飼養水溫對草魚溶菌酶活性的影響. 中國水產科學，1996，3(3)：24~30] Effect of HB-101 on Non-specific Immune Function and Disease Resistance in Juvenile Soft-shelled Turtles (Pelodiscus sinensis) by Oral Administration Qin Chuanjie1) Xu Zhen1) Xiao Zhimeng1) Chen Changfu1,3) (1) Fishery College of Huazhong Agricultural University, Wuhan, 430070； 2)State Key Laboratory of Agricultural Microbiology of of Huazhong Agricultural University, 430070) Abstract The effect of the dietary HB-101 non-specific immune function and disease resistance in juvenile soft-shelled turtle (Pelodiscus sinensis) was studied. The turtles were divided into 6 groups and were fed with feed supplemented with different ratio of HB-101, that was 0 mg/kg(control group)、10.0 mg/kg.B.W.(group I)、20.0 mg/kg.B.W.(group Ⅱ)、30.0 mg/kg.B.W.(group Ⅲ)、40.0 mg/kg.B.W.(group Ⅳ)and 50.0 mg/kg.B.W.(group Ⅴ), respectively. 30 days later, the turtles were blooded, and the phagocytic activity of the leucocytes, serum lysozyme activity, complement activity and disease resistance were monitored. The results showed that the phagocytic activity of the leucocytes were significantly higher than the control group (t-test, p<0.05).The lysozyme activity of the serum in group Ⅲ, Ⅳ and Ⅴ were significantly higher than the control group (t-test, p<0.05). However, there were no significant differences among group Ⅰ, Ⅱ and the control group (t-test, p>0.05). The highest complement activity of the serum in group Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ and Ⅴ were significantly higher than the control group (t-test, p<0.05), which were no significant differences between group Ⅰ and control group (t-test, p>0.05). The results demonstrate that the best supplementation ratio of the activite yeast cell in the soft-shelled turtle is about 20.0 mg/kg. B.W. Keywods juvenile soft-shelled turtle, HB-101, lysozyme, complement, disease resistence, Aeromonas hydrophila www.hb-101.com.cn/report/report_yu_1.htm

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