請高手分析飼用植酸酶活性的檢測結果總是很低的原因。

fangke3546

剛開展飼用植酸酶活性的測定這個項目，檢測結果總是很低，相差很大，不知道是什么原因，方法如下：

飼用植酸酶活性的測定

一、適用范圍
  

本標準規定了以分光光度法測定飼用植酸酶活性的方法。適用于作飼料添加劑用的植酸酶產品，也適用于添加有植酸酶的配合飼料、濃縮飼料和添加劑預混合飼料。樣品最低檢出量為90U／kg。
二、方法原理
  

植酸酶在一定溫度和pH條件下，水解低物植酸鈉，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中，用釩鉬酸銨處理會生成黃色的[(NH4)3PO4NH4VO3·16MoO3]復合物，在波長415nm下進行比色測定。
三、試劑和溶液

3.1
乙酸緩沖液(I)，c(CH3COONa·3H2O)為0.25mol／L：稱取34.02g三水乙酸鈉于1000 mL燒杯中，加入1000mL蒸餾水溶解，用冰乙酸調節pH至5.50±0.01。室溫下存放2個月有效。
3.2
乙酸緩沖液(Ⅱ)，c(CH3COONa·3H2O)為0．25mol／L：稱取34.02g三水乙酸鈉，0.5 g TritonX-100, 0.5g牛血清白蛋白于1000mL燒杯中，加入1000mL蒸餾水溶解，用冰乙酸調pH至5.50±0.01，室溫下存放2個月有效。
3.3
植酸鈉溶液，c(C6H6O24P6Na12)為7.5mmol／L：稱取0.6929g肌醇六磷酸鈉(C6H6O24P6Na12)于100mL容量瓶中，用乙酸緩沖液(3.1)溶解并定容至刻度，現用現配(實際反應液中的最終濃度為5.0 mmol／L)。
3.4
硝酸溶液：1+2水溶液。
3.5
100g／L鉬酸銨溶液：稱取10g鉬酸銨[(NH4)6Mo7O24·4H2O]于100mL。容量瓶中，加入1．0mL氨水(25％)用水溶解定容至刻度。
3.6
2.35 g／L釩酸銨溶液：稱取0.235 g釩酸銨(NH4VO3)于100mL棕色容量瓶中，加入2 mL硝酸溶液(3.4)，用水溶解定容至刻度。避光條件下保存一周有效。
3.7
顏色終止液：移取2份硝酸溶液(3.4)，1份鉬酸銨溶液(3.5)，1份釩酸銨溶液(3.6)混合后使用，現用現配。
3.8 磷酸二氫鉀(KH2PO4)：基準物。
3.9
清洗試驗用容器不要用含磷清洗劑。
四、儀器和設備
4.1
實驗室常用儀器設備.
4.2
恒溫水浴：(37±0.1)℃。
4.3
分光光度計：有10mm比色皿，可在415nm下測定吸光度。
4.4
磁力攪拌器。
4.5
渦流式混合器。
4.6
酸度計：精確至小數點后2位。
4.7
離心機：轉速為4000r／min以上。
4.8
秒表
五、試樣制備
   
取有代表性樣品，用四分法將試樣縮分至200g，植酸酶產品不需粉碎，配合飼料和添加劑預混合飼料需粉碎通過0.45mm標準篩，裝入密封容器，防止試樣成分變化。
六、測定步驟
6.1 標準曲線
   
準確稱取0．6804g在105℃烘至恒重的基準磷酸二氫鉀(5．9)于100mL容量瓶中，用乙酸緩沖液(3．1)溶解，并定容至100mL濃度為50.0mmol／L。準確移取磷標準溶液（50mmol/L）0，1.0，2.0，3.0，4.0， 5.0ml于50ml容量瓶中，與試樣一起反應測定，以無機磷濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，列出直線回歸方程(y＝ax+b)。
6.2 試樣溶液的制備
   
稱取0.5g—0.7g兩個試樣(表示酶活為6000U)精確至0.0001 g，同時稱取0.5g—0.7g參考樣(已知活性的植酸酶),分別置于100mL容量瓶中，加入約70mL乙酸緩沖液(3.2)，一個磁力棒，在磁力攪拌器上高速攪拌30min，用乙酸緩沖液(3.2)定容至刻度(減去磁力棒的體積)。搖勻，在離心機上以4000r／min離心10min。
分取1ml上清液,用乙酸緩沖液(3.2)定溶至100ml，搖勻,再吸取稀釋后的溶液10ml用乙酸緩沖液(3.1)定溶至100ml.使樣液濃度保持在0.08U／mL左右，待反應。
6.3 反應
   
取10mL試管按下面的反應順序進行操作，在反應過程中，從加入底物(3.3)開始，向每支試管中加入試劑的時間間隔要絕對一致，37℃水解30min。反應步驟及試劑、溶液用量見表2。
6.4
樣品測定



反應后的試樣在室溫下靜置10min，如出現混濁需在離心機上以4000r／min離心10min，
上清液以標準曲線的空白調零，在分光光度計415 nm波長處測定樣品空白(A0)和樣品溶液(A)的吸光值，A-A0。為實測吸光值。用直線回歸方程計算植酸酶的活性。
   

表2

反應順序	樣品、標準	樣品空白(標準空白)
1．加入待反應液	2.0 mL	2 mL
2．37℃預熱5 min	√	－
3．依次加入底物(3.3)	4 mL	4 mL(第二步)
4．混合	√	√
5．37℃水解30min	√	－
6．依次加入終止液(3.7)	4 mL	4mL(第一步)
7．混合	√	√
總體積	10 mL	10 mL

七、結果計算

  

式中：
U——試樣中植酸酶的活性，U／g；
   
C——根據實際樣液的吸光值由直線回歸萬程計算出的酶活性，U；
   

F——試樣溶液反應前的總稀釋倍數,50000；
   
M——試樣質量，g；
   

30——反應時間，min。
7.2
結果表示
   
兩個平行樣品的測定結果用算術平均值表示，保留整數。
7.3重復性
   
同一樣品兩個平行測定值的相對偏差，植酸酶產品不大于8％，添加植酸酶的各種飼料樣品不大于10％。

薛侃

你這個問題好像很難哦，可能就只有植酸酶生產廠家才測這個指標。所以能跟你討論的人應該很少。但我期待高手的出現！

zhengronghai

使用哪家的植酸酶啊？

fangke3546

倒是大廠家的
按理說不應該這樣的，TritonX-100對檢測結果的影響到底有多大啊

tgz5637

哈哈，剛好我就是高手，很多賣酶的恐怕連酶檢測的基本概念都沒弄清。今天毛遂自薦、魯班面前耍大刀，關公面前弄弄斧。
1 牛血清白蛋白是穩定劑，TritonX-100是表面活性劑，在分子生物學實驗里用得很多。兩個一塊用，無非是減少酶樣被浸提萃取及稀釋過程中酶的失活，減少酶在試管壁殘留，缺點是用量大后，產生的泡沫很多，不容易定容，可以稍微加幾滴無水酒精消泡，（乙醇在酶工業也用于提取，但濃度和時間有限制，濃度上限是20～30%（V/V)）,實際上，對于沒有加入飼料里的純酶檢測，如果馬上測定，不加影響不大，（但記住做標準曲線時，也不能用乙酸緩沖液2，保證同樣條件才可以），如果用加了穩定劑的緩沖液，比用不加的測定結果高一些。加入飼料的檢測，由于要萃取，故此要加，而且，穩定劑的添加量要加大。
2  檢測偏低情況，多數是底物配制出問題，稱重很少出問題（除非你的儀器很久沒有校正了），必須先調 pH，再來用緩沖液定容。（緩沖液在其緩沖范圍，如乙酸鹽的緩沖范圍是pH3.6～5.8，都有一定緩沖能力，調好pH再定容后的pH是不會改變的）。先定容后調pH,導致底物濃度不足，結果偏低。只用緩沖液溶解植酸鈉，不調pH,直接定容，測定結果也是偏低，因為pH偏離5.5。
3
怎樣來理解酶活的定義呢？對采用分光光度法，采用的原理是對等比色，即同樣的確定條件下，
一個酶活單位分解植酸產生的產物的吸光度值等同于一微摩爾無機磷與顯色劑產生的吸光度值。在得到的標準曲線上找出測定吸光值對應的無機磷的量，返推出酶活大小。要注意回歸方程的得到的代表無機磷量的單位是什么？你才能理解計算公式的含義。

另一種情況的可能性是你做標準曲線和計算公式根本就不正確，導致計算公式錯誤，結果偏低。
如果磷酸二氫鉀的濃度對OD值做標準曲線，濃度單位是微摩爾/mL, 回歸方程單位也換算成微摩爾/mL，計算公式=（回歸方程×稀釋倍）/(稱樣量×30)；如果是以磷酸二氫鉀的物質的量對OD值做標準曲線，物質量單位是微摩爾，計算梯度時，要乘以0.2。計算公式=（回歸方程×稀釋倍）/(0.2×稱樣量×30)；

怎樣做標準曲線，可以找書自己看看。

4 例子：5000單位的植酸酶，稱樣0.8g,稀釋10000倍，OD=0.320, 回歸方程以磷酸二氫鉀的物質的量對OD值做標準曲線，為y=7.840x+0.002,代入第二公式計算，酶活=7.840×0.320×10000/(0.2×0.8×30)=5220u/g

5 其他可能出問題的地方，多數是些低級錯誤！
       可能就是顯色劑配制沒配好，多數出在礬酸銨沒溶解好，量不夠，顯色偏低。如果偷懶，沒有每次重配顯色劑后，重測標準曲線，就套用原來的回歸公式，就犯錯。或者查查硝酸液配對沒有。
      又或者植酸酶的萃取浸提時間不足，以上清液來測，酶活自然偏低。
      或者你的恒溫槽恒溫溫度有誤。或者分光光度計有問題。不是單色光，向濃度軸發生偏離。自然測定值低。
       不是自己測定回歸方程，而是使用別人提供的或在其他機器上測定的回歸方程，計算自然謬誤差之千里。

[ 本帖最后由 tgz5637 于 2008-6-20 10:52 編輯 ]

fangke3546

不勝感激,請問我應該怎么樣來檢驗上述環節是否存在問題,怎樣解決這些問題呢
另外,我還想請問在計算的時候國家標準上提到"C——根據實際樣液的吸光值由直線回歸萬程計算出的酶活性，U",那C是怎么計算的啊?
我能貿然問一句,我能否電話與你聯系?

微塵

華南農大近期有個有關酶制劑的檢測培訓，是個不錯的學習機會

fangke3546

什么時間,有具體信息嗎

fangke3546

tgz5637的分析非常透徹,我剛剛接觸植酸酶不久,不清楚各個因素的影響到底有多大,tgz5637能否更詳細的分析評估一下各個因素的影響.
我的磷標準曲線的回歸方程的系數沒你的大,我的只有二點幾,不知到怎么回事,我懷疑標準曲線的制作也存在一些問題.
我的郵箱是aipu_tchx@yahoo.com.cn,方便的話可否告知電話號碼.

fasetuan

確實是個很深奧的問題,沒有測過這個項目,學習中......