應用 RT- PCR 檢測鴨肝炎病毒Ⅰ型感染

peteryuanfeng · 發表于 2008-8-20 21:24:11

應用 RT- PCR 檢測鴨肝炎病毒Ⅰ型感染
羅玉均 1，張桂紅 1，陳建紅 2，張濟培 2，潘全會 1，鐘植文 1，何逸民 1，孔留五 1
（1.華南農業大學獸醫學院，廣東廣州 510642；2.佛山科學技術學院生命科學學院，廣東佛山 528231）
中圖分類號: S858.32 文獻標識碼: A 文章編號: 1005-8567(2007)03-0020-02
收稿日期: 2007- 03- 15
鴨肝炎病毒Ⅰ型(duck  hepatitis  virus  Ⅰ，
DHVⅠ)感染是雛鴨的一種急性高度致死性傳染病，
主要侵害 4  周齡以內的雛鴨，特別是 1 周齡以下
的雛鴨最易感染，死亡率較高，是危害養鴨業最為
嚴重的傳染病之一[1]。1945 年在美國首次發現，我
國于 1963 年在上海首次報道了該病的臨床病例，
至今，全國各養鴨地區均有不同程度的發生和流
行。目前，已有多種檢測 DHVⅠ抗原的方法，如免疫
電鏡、Dot-ELISA 和病毒中和試驗等，這些方法在
DHVⅠ的診斷中各有優勢。PCR  作為一種新的分子
生物學檢測技術，具有靈敏度高、快速、特異、操作
簡單等優點[2～4]。本實驗通過目前已發表的 DHVⅠ基
因組序列相對保守的區域設計引物，成功建立了
RT-PCR 方法檢測鴨肝炎病毒 1 型。
1 試驗材料
1.1 病料無菌采集廣東省 2 個地區（南海、三
水）送檢的病死鴨肝臟病料各 1 份，置于 -20℃保
存備用。
1.2 參考毒株鴨肝炎病毒 I 型，新城疫病毒
（NDV  clone-30）和禽流感滅活病毒(AIV)（H
5
和
H
9
亞型）。
1.3 主要試劑 Trizol  試劑、EX-Taq  DNA  聚合
酶、2.5  mmol/L  dNTP、AMV  反轉錄酶、RNA 酶抑制
劑（Rnasin）、10.0  mmol/L  dNTP、Marker2000  均
購自 TaKaRa 公司；其它試劑均為國產分析純。
1.4 引物參照 GenBank 中發表的 DHVⅠ全基
因序列，應用生物學軟件 Primer5.0 設計擴增
DHVⅠ3D 基因序列的特異性引物，引物序列為 F:
5-ATgTACCACTgTggTCATT-3，R:5-TCTTCAgAATTCA
TCTC-3，擴增片段長度為 250  bp，由上海 Sangon
生物公司合成。
2 方法
2.1    病料樣品的處理    取無菌采集的病料
0.2～2.0  g 于玻璃研磨器中，研磨并用 TEN  緩沖
液稀釋成 1:3 乳劑，置于 EP 管中，-20℃/ 室溫反
復凍融 3 次，每次融化時使其在室溫中緩慢融化，
以便細胞破裂使病毒釋放出來。融化后的溶液以
4  000  r/min 離心 10  min，取上清經除菌濾器過
濾。濾液 -20℃保存備用。
2.2 核酸的抽提    按 TRIZOL  Reagent  說明書
提取 AIV(H
5
和 H
9
)、NDV  、DHVⅠ總 RNA。
2.3 cDNA 的合成取抽提的 RNA 樣品進行反
轉錄。采用 20μL 反轉錄體系，其中含 1μL(25
nmol/L)  下游引物、2μL  10.00  mmol/L  dNTP、
4μL  5×RT-PCR 緩沖液、1μL  (40  U/L)AMV 酶、
8μL  RNA 模板、1μL  RNase 抑制劑，最后用 DEPC
水補至 20μL。42℃水浴 1  h，合成 cDNA，置 -20℃
保存備用。
2.4 RT- PCR 擴增以 DHV  I  cDNA 為模板進行
PCR 擴增。反應體系為 25μL，其中 EX-Taq 酶預混
劑，25  nmol/L 的上、下游引物各 0.5μL，模板
2μL，加滅菌水補足體積至 25μL。旋渦震蕩，混勻
后置于 PCR 儀中擴增。擴增程序為：94℃  3  min，1
個循環；94℃  1  min、49℃  1  min、72℃  1  min，30
個循環；72℃延伸 5  min。產物通過電泳進行檢測。
2.5 特異性試驗以 DHVⅠ、AIV  (H
5
和 H
9
)、NDV
進行特異性檢驗。
2.6 敏感性試驗將 DHVⅠ的 cDNA 用紫外分光光
度測其含量為 0.6μg  /μL，然后進行 10 倍系列
稀釋，然后進行 RT-PCR 擴增，以檢測其敏感性。
2.7 臨床樣品的檢測按上述方法對臨床病例
的組織樣品進行 RT-PCR 檢測。
3 結果與分析
3.1 特異性檢驗結果見圖 1。以 DHVⅠ擴增出
與試驗設計相符的 250  bp 電泳條帶，而對照的
AIV(H
5
和 H
9
)、NDV 擴增結果為陰性。
3.2 敏感性擴增結果見圖 2，該 RT-PCR  可以
檢測到 0.06  ng/μL  DHVⅠ的核酸模板。圖 1 RT- PCR 特異性擴增結果
M: Mar ker  DL2000; 1. DHVⅠ; 2. AI V; 3. NDV
圖 2 RT- PCR 敏感性擴增結果
M: Mar ker  DL2000; 1: 0. 6  μg/ μL; 2: 0. 06  μg/ μL;
3: 6  ng/ μL; 4: 0. 6  ng/ μL; 5: 0. 06  ng/ μL; 6: 1  pg/ μL
3.3 臨床病料檢測結果見圖 3。
圖 3 臨床病料檢測結果
M: Mar ker  DL2000; 1: 陰性對照;
2: 南海 DHVⅠ病料; 3: 三水 DHVⅠ病料。
4 討論
成年鴨在自然條件下被 DHVⅠ感染后，可長期
帶毒和排毒而不出現臨床癥狀，但進入環境中的
DHVⅠ對 4 周齡內的雛鴨卻有高致病性，從而導致
該病毒在鴨群中廣泛傳播[1]。因此，建立快速、敏感、
特異的診斷方法是有效預防和控制該病的關鍵措
施之一。目前，對 DHVⅠ的診斷主要依靠流行病學
資料、臨床癥狀、病理變化及病毒的分離和鑒定。雖
然目前實驗室 DHVⅠ檢測方法有病毒的分離、
ELISA 與中和試驗(VN)等，但這些方法用于檢測感
染 DHVⅠ的死亡鴨組織中的病原時存在不足，如檢
測所需時間長、敏感性較低等，臨床應用受到一定
的限制。本實驗通過建立 RT-PCR 方法，快速檢測感
染 DHVⅠ的死亡鴨組織，而且檢測結果表明該方法
具有較高的特異性與敏感性。RT-PCR 為 DHVI 的臨
床診斷及流行病學調查提供了可行的方法。
參考文獻:
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獸醫臨床
應用 RT- PCR檢測鴨肝炎病毒 I  型感染—羅玉均, 等
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