在發酵的角度廓清“后抗生素時代”的含義

葉赫娜蘭.孤城

大家都說“后抗生素時代”，除了歐盟禁抗帶來的畜牧行業的緊迫外，它的含義還有另一個。n

那就是，在以往（2005-2006以前），發酵處于抗生素時代。抗生素時代的含義，是指，以抗生素工藝代表最高發酵技術，引導行業。以抗生素工藝評價體系為整個發酵行業的指導。也即，抗生素發酵工藝，指導了有機酸（主要檸檬酸）行業，氨基酸（主要味精）行業的生產構成體系。
抗生素發酵，是經典發酵的代表。

所謂后抗生素時代，指進入分子時代后，工程菌由于自身原因不適應以抗生素發酵為指導，而自身發展了一種開發，生產，和評價體系。工程菌株的高精度控制發酵，代表了行業的最高水平。

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后抗生素的時代特點，有點和經典發酵時代不同，在經典發酵時代，抗生素工藝技術涵蓋了，指導了整個發酵行業，但后抗生素時代，分子技術和工程菌發酵技術，并不能代表整個行業。

它與經典發酵，即抗生素工藝指導下的發酵，是同時存在的。 這一點，與抗生素時代不同。

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下面，以蛋白表達為例，大致闡述下后抗生素時代的技術過程，然后，再做一下對比。

先闡述大致工藝過程：

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蛋白表達的技術與工藝概述

在分子生物學角度講，找到或合成外源蛋白基因，構建質粒，并導入細胞以表達具有生物活性的折疊正確的蛋白，是一種成熟的常規技術。目前，包括酶，抗原，抗體，激素，其他小分子調節蛋白在內的很多蛋白，都已經用這種技術實現了工業化生產。在具體的工藝選擇上，歷史沿襲習慣和表達體系的選擇，對工藝穩定性，成本，有巨大的影響。

目前，常用的蛋白表達系，有3個類別：

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1，大腸桿菌表達系。
大腸桿菌的遺傳背景十分清楚，代謝相對簡單，發酵副產物少，在不是很嚴格的情況下，是表達蛋白的首選。通過按經驗選擇合適的菌株及合適的質粒，既可以以包涵體的形式得到大量的目標蛋白，又可以在細胞外得到可溶性蛋白，是常見的一種表達系。

2，酵母菌表達系。
用酵母做表達系，理由之一，也是遺傳背景清楚，而且，當蛋白分子量過小，不能形成包涵體時，或蛋白的二硫鍵過多，不易體外復性時，酵母菌就成了合適的選擇。另外，酵母對蛋白也會有一個簡單的修飾，近似于高等動物的蛋白糖基化過程。這樣，在合成在體液中發揮作用的蛋白，而且，又不能（技術水平限制）用動物細胞時，就可以退而求其次的選用酵母菌表達。一般是用信號肽把蛋白導出細胞，在發酵液中以可溶性蛋白的形式存在。這也是一個常見的表達系。

3，動物（或說，人的）細胞表達系。
這種情況，在純度或毒性方面有較高要求的產品應用。一般國外產品應用較多，國內還沒有用動物細胞表達蛋白實現商業化生產的報道。由于技術限制，國內工業化生產用這個方法目前還有較大難度。

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這3種表達系，各自有自己的優缺點。首先，在潛在的毒性影像方面講，由于和真核生物親緣關系太遠，大腸桿菌就最不合適。其次是酵母菌。而在表達量和代謝控制成本上來講，酵母菌和動物細胞又是差強人意的。現在，很多蛋白習慣性的選用酵母菌做表達系，就是因為早期提取蛋白技術低下，而動物細胞培養技術又不過關的原因所致。目前，雖然提取工藝提高了，但作為蛋白這種高附加值產品，運作成本集中在銷售而不是生產，所以，降低生產成本的訴求很低。站在降低開發難度的角度講，一方面，質粒構建和質粒與菌株的匹配方面依賴大量經驗，另一方面，發酵工藝策略選擇與發酵工藝優化又需要很大的投入，所以，技術開發部門沿用自己熟悉的，已經積累了大量經驗的表達系，是合理的。

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不過，隨著分子技術進一步的發展，分子技術進入低附加值的產品領域又是必然的，降低生產成本就變的越來越必要了。

大腸桿菌表達系有兩種得到外源蛋白的方法：

1，緩慢的表達，得到可溶性蛋白，這種方法產量和酵母菌表達類似，與酵母菌比，不具有明顯的優勢，一般是有做大腸桿菌傳統的研究機構生產小分子蛋白的一種沿襲性做法。

2，使用T7啟動子表達蛋白，這樣，高速的蛋白表達速率使蛋白來不及折疊，在細胞內形成非水溶性的包涵體。最后目標蛋白可以達到總細胞質量的15%-25%，這樣，就為降低成本提供了一種可能。

不過，在使用T7啟動子表達時，也存在兩個難點：

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1，蛋白的復性技術，如果形成可溶性蛋白，那利用（使用分子技術加載在目標蛋白上）信號肽，只要過一遍柱子就能分離得到純度非常高的，具有生物活性的產品，而形成包涵體，對提取，復性就有較高的要求，特別是二硫鍵的存在，會對復性產生很大的影響。在目前國內和國際流行技術看，并不是所有的蛋白都能在預定成本下復性的。

2，任何情況下，高產都是代謝網絡互相依賴與作用的結果。在如此高的表達量下，甚至細胞的形態都已經發生很大變化，正常代謝受到嚴重干擾，以至于放大時，搖瓶工藝對發酵工藝幾乎沒有任何參考價值。發酵工藝策略的選擇將直接依賴于工程人員在生化，生理水平對菌株的理解，而匱乏可資參考的數據資料。發酵工藝的優化要離開搖瓶經驗在發酵罐上逐步進行，這樣，整個發酵工藝的確立就需要比想象中要大得多的人員與時間的投入。

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另外，再說一下糖基化的問題。

在動物細胞內合成的折疊正確的蛋白，在分泌入體液前會有一個糖基化的過程，加上一個糖鏈就不會很快被蛋白酶當做折疊錯誤的蛋白水解掉。但是以微生物為表達系表達的蛋白，不具有動物細胞的修飾過程，用大腸桿菌表達的目標蛋白，很快會在血液中被降解。解決或回避這個問題，有兩種方法：

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1，用動物細胞表達，一般，是用癌化的人類細胞。由于動物細胞培養技術要求過高，在國外比較昂貴的醫藥中有應用，國內不常見。

2，由于酵母菌也有一個對蛋白的粗略的修飾過程，可以用酵母菌表達目標蛋白。這個技術，國內國外都在用，可以是一個權宜之計。主要難點集中在對合適菌株的分子水平的改造，以達到盡可能接近滿意的修飾效果。