甜菜堿的檢測

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分析方法

使用HPLC測定甜菜糖漿和液體或晶體甜菜堿產品中甜菜堿和某些其他成分的含量

前言
本方法可以用來檢測甜菜糖漿和液體或晶體甜菜堿產品中甜菜堿、某些糖和糖醇的含量。通過使用強陽離子交換柱（Na+,Ca2+或Pb2+形式〕的高效液相色譜（HPLC〕和折光率檢測器（RI）可以達到目的。

結晶芬菜堿S6產品中含有相當數量的硬脂酸鈣，在進行樣品預處理的時候必須考慮到這點。

用來進行測定的HPLC系統必須有相應的維護程序，交換柱和管線必需定期清洗以保持系統狀態的穩定。

設備和試劑

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HPLC系統
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等速泵，0.6毫升/分鐘，如沃特斯公司的Waters 510
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自動進樣器，如沃特斯公司的Waters 717+
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柱溫為75℃（Na-柱）或85℃（Ca-柱或者Pb-柱〕的交換柱，如沃特斯公司的Waters CHM
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RI檢測器，如沃特斯公司的Waters 410
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合成和數據處理系統，如沃特斯公司的WatersMillennium

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Na或Ca形式的保護柱，Pb柱用陰陽離子交換預備柱的形式保護。可以使用如Bio-Rad125-0508(Na),Bio-Rad 125-0128(Ca),Bio-Rad 脫灰分柱125-0118(Pb)
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有機濾器，如Guard-Pak TM BondakapC18.Waters,Ltd.
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機械濾器，如Upchurch ScientificOn-line frit A103x
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分析柱，Na+、Ca2+或者Pb2+形式的強陽離子交換柱，如Transgenomic Coregel 87N或者CHO 820 和Bio-Rad Aminex HPX-87P?

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洗液，超純水（蒸餾，去離子，過0.2 um(微米)濾膜）適用于Pb柱，超純水配制的0.001MNa2SO4溶液適用于Na柱，0.001M Ca(NO3)2適用于Ca柱
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0.2um(微米)濾膜,如Schleicher& Schuell ME 24
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分析天平,如MettlerPC 440和Metttler AE100
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抽氣泵，如KNF MW63/4
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過濾系統，如Gelman
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水純化裝置，如Gelman Water-1→ultra pure water
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超聲波清洗器，如Branson 5200
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0.2um的注射過濾器，如Gelman Nylon Acrodisc 13
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加熱器
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冷卻水恒溫器(20±0.5℃)
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容量瓶,如100ml
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Na2SO4，如 Merck 6649
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Ca(NO3)2·4H2O，如Merck 1.02123
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甜菜堿標準物，如Fluka 14300（一水化合物）
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KCl，如Baker0509
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棉子糖，如Merck 73301（五水化合物）
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蔗糖，如Fluka 84099
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半乳糖，如Merck 41726
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肌醇，如Fluka 57570
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果糖，如Merck，104007
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甘油，如ICN Biomedicals 800687
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赤蘚糖醇，如Acros 11782
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甘露醇，如 Fluka 63559
其他可能用到的物品。

操作程序
配制Na-柱沖洗液
稱取0.710克無水硫酸鈉放入5000ml容量瓶中，注入超純水至容量瓶容量的一半左右。加入幾滴1M NaOH溶液調整pH至9.0。混合均勻后加入超純水至刻度。

配制Ca-柱沖洗液
稱取1.18克硝酸鈣（含四個結晶水）放入5000ml容量瓶中，注入超純水至容量瓶刻度，然后混合均勻。

配制Pb-柱沖洗液
使用超純水

如果需要的話，可以將配制好的沖洗液經0.2um的濾膜過濾（視水的質量狀況而定）。將裝有洗液的5000ml容量瓶用超聲處理15分鐘后，將其接入HPLC系統。洗液應該保持在60℃以防止產生氣泡。

標準液
精確稱取下述成分，然后在20℃條件下用蒸餾水稀釋至100ml。將稀釋好的樣品經注射
過濾器（0.2um）過濾后收集到集樣瓶中。如果使用無水甜菜堿，應該將其在140℃至少干燥24小時，然后儲存在干燥器中（最多存放兩周）。由于幾乎很難將無水甜菜堿完全保持干燥,因此可以使用含有一個結晶水的甜菜堿作為標準品,但是要經常檢測其含水量(使用KarlFisher法)。

甜菜堿標準樣		Pb標準樣	三點校正，標樣1
Na-和/或Ca-柱	Pb-柱
KCl	120mg	蔗糖	200mg	KCl	120mg
蔗糖	200mg	葡萄糖	100mg	棉子糖	30mg
葡萄糖	80mg	果糖	300mg	蔗糖	100mg
半乳糖	80mg	甘油	200mg	葡萄糖	10mg
肌醇	80mg	赤蘚糖醇	200mg	半乳糖	10mg
甜菜堿	700mg	肌醇	250mg	肌醇	10mg
		甘露醇	250mg	甜菜堿	500mg
蔗糖標準樣				三點校正，標樣2
Na-和/或Ca-柱
KCl	120mg			KCl	120mg
棉子糖	100mg			棉子糖	20mg
蔗糖	600mg			蔗糖	300mg
葡萄糖	80mg			葡萄糖	30mg
半乳糖	80mg			半乳糖	30mg
肌醇	80mg			肌醇	30mg
甜菜堿	150mg			甜菜堿	200mg
				三點校正，標樣3
				KCl	120mg
				棉子糖	10mg
				蔗糖	500mg
				葡萄糖	20mg
				半乳糖	20mg
				肌醇	20mg
				甜菜堿	50mg

樣品溶液
如果可行的話用折射計測量樣品中干物質的含量并將其轉換為甜菜堿的干物質量(使用Brix/甜菜堿 干物質表)。或者使用 Karl Fisher干物質。準確稱取大約1克（干物質 ）的樣品溶于100ml容量瓶中，用超純水定容至刻度。將樣品稀釋液通過注射過濾器（0.2um）
后收集到集樣瓶中。

結晶樣品：稱取0.7g（使用分析天平）晶體至容量瓶中，用超純水定容至100ml。將樣品稀釋液通過注射過濾器（0.2um）后收集到集樣瓶中。
芬菜堿S6 樣品必須充分混勻，因為其中的硬脂酸鈣難溶于水。稱取樣品（0.7g，使用分析天平）至玻璃瓶當中，然后添加超純水至100.0000g。用玻棒充分攪拌后倒入混合器中，混合大約1分鐘使其充分作用。將充分混合后的樣品溶液通過注射過濾器（0.2um）后收集到集樣瓶中。


色譜分析
洗液：0.001MNa2SO4（Na-柱）或者0.001MCa(NO3)2（Ca-柱）溶于超純水中，通過0.2um濾器。對于Pb-柱,直接使用超純水。
柱溫：75℃（Na-柱）或者85℃（Ca-或Pb-柱）。
流速：0.6ml/分鐘（Na-和Ca-柱）或者0.6ml/分鐘（Pb-柱）。
進樣量：10ul（微升）。
時間：Na-柱,15分鐘。如果樣品很臟或者含有洗脫很慢的組分時，跑柱時間可以延長到30～40分鐘以防止干擾下一次的測量。Ca-柱，35分鐘，Pb-柱,50分鐘。
使用外標法測量。根據測得的峰高，通過數據處理系統計算出結果。如果柱子的狀態不佳并且波峰不尖的話，將根據波峰的面積而不是高度來計算。然而，大多數情況下，使用使用峰高計算更為合適。

單點校正時，使用兩次標準樣的平均值。當單點校正不能被接受的時候，可以使用其它的方法。特別是當分析很少量的樣品時，可使用三點校正。如果三點校正是線性的并且通過零點，那么微量的樣品也能很準確地測量出來。

應該使用已知組份的樣品作為參比樣，或者使用其它已經有校正曲線的樣品作為參比樣。對于Na-和Ca-柱，最好使用甜菜堿LQD樣品。測定參比樣的純度時至少要有6個平行樣品，最后取平均值。對于Pb-柱，使用甘油作為參比樣。

請使用控制表來監測分析結果。在最初的6次運行時，測定結果的最大偏差不應該超過2倍標準差(2×std)。系統的誤差也需要控制在一定的范圍內，比如可以通過將標準液作為樣品在最后的時候測試分析，允許的最大偏差為0.5%單位（即測定結果為100%±0.5%）。

處理樣品（常規最佳處理方式）通常使用Na-柱。對于Na-／Ca-柱，單點校正時進樣兩次，取平均值。如果樣品中甜菜堿含量較高，請使用甜菜堿標準樣；如果認為樣品中蔗糖含量較高，請使用蔗糖標準樣。當標準樣跑完柱子以后，立刻注入參比樣并且確保結果在允許的誤差范圍內（使用控制表）。當分析6個樣品后，要棄掉舊的標準曲線并重新制作（2×std，參比樣，處理樣品）。

結晶產品、芬菜堿LQD和甜菜糖漿通常也是適用于Na-柱分析。對于Na-／Ca-柱，單點校正時進樣兩次，取平均值。使用甜菜堿標準樣或者含甜菜堿的標準樣作為單一組分（0.7g/100ml）。當標準樣跑完柱子以后，立刻注入參比樣并且確保結果在允許的誤差范圍內（使用控制表）。分析2－3個樣品并且每個樣品進樣兩次。計算兩次進樣的平均值并報告。在棄用舊的標準曲線時，以標準液作為樣品測試兩次以檢測系統的誤差。然后重新開始（2×std，參比樣，2次進樣，以標準樣為樣品測兩次）。如果兩次進樣的結果偏差小于0.5%個單位，參比樣在檢測范圍內并且以標準樣為樣品的測定結果為理論值的100±0.5%，那么測定結果可以被接受。






結果
結果以%/自然重量或者%/干物質（用含水量校正）表示。

計算

結果由下面的公式計算得出

C(X)=	100×A×100	%/dm
	m(樣品)×dm
C(X)=	100×A	%/nw
	m(樣品)
C(X)=	樣品中甜菜堿的含量，以%/dm或者%/nw來表示
A=	集樣器給出的濃度，以mg/ml為單位
m(樣品)=	樣品重量，以毫克（mg）為單位
dm=	干物質
nw=	自然重量

誤差來源
如果管線的清洗不夠充分、管線或柱子中粘有結塊，那么在色譜中會出現未知峰或者當僅僅注入蒸餾水的時候也會在色譜中出現峰。請沖洗管線和柱子并且使柱子再生。

保留時間的少許變化是可以接受的，但是如果保留時間的變化太大的話，柱子的離子形式可能會改變。請清洗系統并且使柱子再生。

如果峰的形狀在變化并且離散度變得很差的話，請更換柱子或者使柱子再生并且重新清洗系統。

可以通過注射0.2M NaOH 1～5次（20～50ul）的方法使柱子快速再生。

每次清洗完柱子以后請確保系統中沒有空氣，盡管做起來會比較困難。可以通過操作自動進樣器的OQ測試來檢測系統中是否有空氣。

如果結果不可靠，請檢查是否所有標準品和樣品已經完全充分溶解稀釋。標準液和樣品溶液在定容以前先經過超聲波處理也許是必要的。

linlejun

蛋雞飼料添加的量比較大些，具體的效果應該還不好說吧！

linlejun 于 2009-8-10 10:00 補充以下內容

蛋雞飼料添加的量比較大些，具體的效果應該還不好說吧！

xinjiang102

本人正在做甜菜堿含量檢測方面的一些研究,可以加我QQ:642463137 一起討論一下.

wycheng_2002

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