離體消化法在篩選水產復合酶中的應用

djhnasa

摘 要
　　采用胰蛋白酶來模擬水產動物消化酶，在胰蛋白酶的基礎上添加復合酶，以探討在水產料中添加復合酶的效果。結果顯示：復合酶A對鯉魚料的消化率很低，僅為3.72%，胰蛋白酶的基礎上添加復合酶A，鯉魚料的干物質消化率從11.55%提高到25.46%；復合酶B對飼料樣品的消化率為2.82%，在胰蛋白酶的基礎上添加酶B，鯉魚料的消化率并沒有提高。這次表明在本實驗條件下，以非淀粉多糖酶為主要酶類的復合酶A可有效破壞降解植物原料的細胞壁，促進消化酶對營養物質的消化，而復合酶B活性可能很低，對飼料消化率沒有改善作用，根據本實驗結果可以推測，對以植物原料為主的理科魚類，復合酶A可能比復合酶B更合適。

關鍵詞
　　離體消化法；水產復合酶；消化率

外源酶制劑可彌補內源酶分泌的不足，也可以提供某些動物體不能分泌的酶類，從而促進動物對飼料的消化消化利用，目前在畜禽料中已廣泛應用。水產用酶制劑也日漸興起，但問題突出，譬如多數水產復合酶制劑并非針對水產動物開發的，其酶的來源與酶活檢測均以畜禽為參照等；實際上，畜禽和水產動物的消化生理差異顯著，不能僅憑酶活測定結果或廠家宣傳就在水產飼料中推廣應用，而需對水產酶制劑在水產飼料中應用的可行性進行評估。養殖試驗是最好的評估方法，但該方法費時費力，采用離體消化試驗，將會節約大量的時間和精力。

本試驗旨在于探討離體消化法篩選水產酶制劑的可行性。采用模擬無胃魚消化環境(溫度、腸道pH值等)，采用一步消化法，用水產酶制劑消化鯉魚料，測定其消化率，為酶制劑篩選提供參考。

1材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1水產復合酶
本次試驗選用兩種水產酶制劑(酶A和酶B)，主要酶活見表1。

1.1.2胰蛋白酶
Trypsin 1：250酶活力：1000～1500U/mg(上海源聚生物科技有限公司)

1.1.3飼料來源
　　為市場購買某公司鯉魚料，樣品均通過105℃烘干處理，粉碎過80目篩保存備用。

表1
復合酶A和復合酶B主要酶酶活

酶A		酶B
有效成分種類	含量(U/g)	有效成分種類	含量(U/g)
果膠酶	55000	淀粉酶	20000
甘露聚糖酶	5000	蛋白酶	11000
中性蛋白酶	2800	果膠酶	900
纖維素酶	2500	纖維素酶	100
酸性蛋白酶	2200	脂肪酶	70
木聚糖酶	2000
Α-半乳糖苷酶	1400
Β-葡聚糖酶	1000
淀粉酶	380

1.1.4
試驗器械及藥品
10mL移液管、250mL帶塞三角瓶、恒溫水浴搖床、烘箱、凱氏定氮儀、冰箱和電子分析天平(感量0.00001g)、試驗用樣品粉碎機、金屬篩(孔徑80目)、電爐、消化爐、電熱式恒溫烘箱、干燥器、過濾裝置、磁力攪拌器、離心機。

1.2 試驗方法

1.2.1
磷酸緩沖溶液制備
精確稱取分子量為358.0的磷酸氫二鈉固體結晶115.992g和分子量為156.01的磷酸二氫鈉11.8568g
于2000mL燒杯中，加入少許去離子水將其溶解，并定容至2000mL，最后用酸度計將pH值調至7.4，保存備用。

1.2.2
酶液制備
水產復合酶酶液制備：稱取5g復合酶制劑于500mL 0.2M pH為7.4的磷酸緩沖溶液中，攪拌30min后靜置沉淀并過濾，所得標準復合酶酶液為0.01g/mL，保存備用。

胰蛋白酶酶液制備:精確稱取胰蛋白酶2.5g于100mL 0.2M pH為7.4的磷酸緩沖溶液中，所得標準胰蛋白酶酶液為0.025g/mL，保存備用。由于沒有勻漿機和冷凍離心機，用胰蛋白酶模擬魚腸道消化酶。

1.2.3
試驗設計
本試驗采用胰蛋白酶來替代水產動物消化酶，具體實驗設計見表2。

1.2.4
離體消化步驟
A、精確稱量飼料樣品1g(精確到0.0001g)于250mL帶塞三角瓶中，添加0.2mol/L pH7.4的磷酸緩沖液100mL ，并按試驗設計添加酶液。

B、28±0.1℃水浴鍋中保溫進行酶水解12h，搖床以 100rpm 振搖進行酶解

C、將酶水解好的飼料樣品過濾瓶(定量濾紙+稱量瓶先在103℃下烘干1h，冷卻器中冷卻恒半小時重后稱重記錄)。將濾渣+定量濾紙+稱量一起在103℃下烘干，恒重后稱重并記錄。

表2
試驗設計

處理組	1（對照）	2	3	4	5	6
0.2M pH7.4磷酸緩沖溶液(mL)	120	110	100	110	100	110
樣品消化添加量(g)	1.0000	1.0000	1.0000	1.0000	1.0000	1.0000
復合酶A(mL)	∕	10	10	∕	∕	∕
復合酶B(mL)	∕	∕	∕	10	10	∕
胰蛋白酶(mL)	∕	∕	10	∕	10	10

1.2.5數據處理
本試驗結果數據處理均采用SPSS 11.0軟件進行方差分析和多重比較。

2
結果與討論

結果見表3。

從消化數據上看出，空白處理組的干物質離體消化率為31.48%,由于空白對照組無添加任何消化酶，可離體酶解實驗的干物質消化率達到31.48%，再結合考慮飼料樣品中水溶性物質應占的比例，出現這種原因的可能是所用飼料樣品在稱量的過程中發生吸濕現象，整體含水量偏大，所以造成實驗結果數據整體偏大，但對處理組間的相對比較和分析無太大影響。

從表3可以看出，處理3樣品飼料干物質離體消化率最大，顯著大于處理1、處理2、處理4、處理5和處理組6(P＜0.05)；其次處理5和處理6干物質消化率顯著大于處理1，其余各組之間無顯著性差異(P＞0.05)。

表3
干物質離體消化率

處理號	酶制劑	樣品消化前后失重（％）	消化率（％）
1	空白對照	31.48±1.22a	.00±.00 a
2	復合酶A	35.20±3.40a	3.72±4.61 ab
3	復合酶A+胰蛋白酶	56.94±4.64c	25.46±3.42 c
4	復合酶B	34.30±3.89a	2.82±5.11 ab
5	復合酶B+胰蛋白酶	42.65±1.34b	11.17±2.55 b
6	胰蛋白酶	43.03±1.65b	11.55±2.86 b

注：同一列內處理間標注字母全部不同表示達0.05的顯著水平標準，無字母標識表示各組間無顯著性差異。

由此可見，復合酶A對鯉魚料的消化率很低，僅為3.72%，和對照組相比消化率沒有得到顯著性提高；但在胰蛋白酶的基礎上添加復合酶A，鯉魚料的干物質消化率從11.55%提高到25.46%。這一結果表明，以非淀粉多糖酶為主要酶類的復合酶A，由于其中的蛋白酶和淀粉酶等酶類含量較低，單獨消化飼料時對飼料消化率沒有明顯改善作用，但由于其中的非淀粉多糖酶能有效的降解植物原料的細胞壁，協助消化酶對營養物質的消化，大大提高了消化酶對營養物質的消化。本試驗條件是模擬無胃魚的消化環境(溫度、pH)，因此根據本實驗結果可以推測，在無胃魚的消化道中，復合酶A可以發揮較好的活性，能有效破壞降解植物原料的細胞壁，促進內源消化酶對營養物質的消化，從而提高飼料消化率。

表4
酶B酶活檢測條件

酶種類	檢測溫度（℃）	檢測pH
蛋白酶	37	3.0
淀粉酶	40	4.5
纖維素酶	40	4.5
脂肪酶	37	7.0
果膠酶	40	3.5

酶B對飼料樣品的消化率只有2.82%，且在胰蛋白酶的基礎上添加復合酶B，鯉魚料的消化率也沒有得到進一步提高。從表1可知，復合酶B中蛋白酶、淀粉酶等酶活很高，但為何對鯉魚料的消化率很低呢？從表4可以看出,復合酶B酶活檢測的溫度都在37℃以上，除了脂肪酶外，其它幾種酶的檢測都是pH小于或等于4.5的條件下檢測的，而本實驗是溫度是28℃，pH為7.4，因此造成復合酶B對鯉魚料的消化率低的原因可能是在本實驗條件下復合酶B活性低。這一試驗結果可以推測在無胃魚的消化道環境中，酶B的活性很低，不能發揮作用。

3
小結

本試驗結果表明，對以植物原料為主的理科魚類，酶A比酶B更合適。

djhnasa 于 2010-3-7 11:41 補充以下內容

補充：本人參與制定的對水產動物的離體消化篩選原料的方法，存在一定的原因，請專家提出

liyan123456

謝謝樓主，學習了