三顆針活性成分——鹽酸小檗堿含量的有效測定方法

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　　三顆針活性成分——鹽酸小檗堿含量的有效測定方法

　　李蔥曉1 王志祥1 宋宏曉2 劉素梅3 劉建華1　 趙蕾1

　　1.河南農業大學 河南鄭州 450002 　 2.河南省洛陽市動物疫病預防控制中心　河南洛陽　471002 3.河南省獸藥監察所 河南鄭州 450008
　　摘要：建立用高效液相色譜法(HPLC)測定三顆針活性成分中鹽酸小檗堿含量的方法。 方法：采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱，乙腈-0.03mol/mL磷酸二氫鉀(體積比為35：65)為流動相;檢測波長：345nm;流速：1mL/min-1;柱溫：25℃。結果：鹽酸小檗堿在2.138-106.9μg范圍內線性關系良好，r=0.999995;具有較好的穩定性、重現性和精密度。結論：該方法準確、可靠、專屬性強，可作為三顆針活性成分中鹽酸小檗堿含量的有效測定方法。
　　關鍵詞：鹽酸小檗堿;高效液相色譜法;三顆針
　　三顆針為小檗科(Berberidaceae)小檗屬(Beris)植物的俗稱，其含有的生物堿主要有小檗堿、小檗胺、巴馬亭、藥根堿等，具有清熱燥濕、瀉火解毒、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、降脂調脂的作用。三顆針活性成分是河南農業大學綠色飼料實驗室擬開發的飼料添加劑。本實驗提取三顆針活性成分，采用HPLC測定其中鹽酸小檗堿的含量。為將三顆針活性成分開發為飼料添加劑的用量提供參考依據。
　　文獻報道[1]測定三顆針中鹽酸小檗堿的含量所采用的方法有紫外、薄層層析法，容量法等。但以上方法誤差大，經查閱資料[2]后，采用高效液相色譜法測定鹽酸小檗堿的含量，并對測定方法進行方法學考查。
　　1 材料
　　1.1 儀器　Waters1525高效液相色譜儀，Waters2487紫外檢測器;MILLI-Q型超純水系統，梅特勒320型酸度計，KQ-250DB型超聲波清洗器，METTLER AE240電子分析天平。
　　1.2 藥材　稱取三顆針根莖，置于10倍0.25%的硫酸溶劑中，在80℃烘箱中浸泡24小時，用4層紗布過濾，濾渣用6倍量硫酸同法再提取1次，合并濾液，加石灰乳調pH=11，靜置過夜，抽濾，濾液中加5%食鹽，靜置過夜，抽濾得濾餅，即三顆針活性成分粗品;粗品加30倍純化水，加熱煮沸5min，趁熱抽濾，濾液在60℃時，加入濃鹽酸調pH=1，靜置過夜，抽濾即得三顆針活性成分精品[3~6]。
　　1.3 試劑　乙腈為色譜純，其它為分析純。鹽酸小檗堿標準品由中國藥品生物制品檢定所提供，編號為713。
　　2 方法
　　2.1 色譜條件　色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(250×4.6mm，5μm);流動相：乙腈一0.03mol/mL磷酸二氫鉀(35：65);流速1mL/min-1;檢測波長345nm;柱溫：25℃，進樣量為10μL。
　　2.2 圖譜 對照品的HPLC圖譜見圖1，保留時間t=7.8min。供試品圖譜見圖2。兩圖譜的小檗堿峰基本一致，理論塔板數為8715。
　　作者介紹：李蔥曉。河南農業大學2005級研究生，專業：動物營養與飼料科學。
　　
　　2.3 對照品溶液的制備　精密稱取鹽酸小檗堿對照品10.69mg，以甲醇溶解并定容于50mL容量瓶中，即為0.2138mg/mL的儲備液。
　　2.4 供試品溶液的制備 精密稱取三顆針活性成分50mg，置50mL容量瓶中，加甲醇溶液約20mL，超聲處理使其全部溶解，加甲醇溶液至刻度，搖勻;精密量取1mL，置50mL容量瓶中，加甲醇溶液至刻度，搖勻，經0.25μm濾膜過濾，取續濾液即得。依法制得1、2、3、4、5五個樣品溶液。
　　2.5 測定 精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定，即得結果。
　　3 實驗結果
　　3.1 線性關系考察
　　分別吸取儲備液適量，配制成濃度(μg/mL)為2、5、10、20、50、100的對照品溶液，按上述色譜條件，將不同濃度的標準品溶液進樣，測定。以峰面積(Y)為縱坐標，以進樣量X(mg)為橫坐標繪制標準曲線，計算回歸方程Y=37073.15X-823.51，相關系數：r=0.999995，r2=0.999990，結果表明：鹽酸小檗堿在2.138-106.9μg之間呈良好線性關系，詳見表1。
　　表1 鹽酸小檗堿進樣量與峰面積線性關系考察結果

進樣量（μg）	2.138	5.345	10.69	21.38	53.45	106.9
峰面積	83965	198472	393925	785752	1980235	3963746

　　3.2 穩定性實驗
　　隨機取1號樣品溶液，于0，0.5，1，2，4，8，12h進行含量測定，鹽酸小檗堿峰面積的相對標準偏差RSD=1.109%，穩定性良好，詳見表2。
　　表2 　穩定性實驗結果

時間（h）	0	0.5	1	2	4	8	12	RSD%
峰面積	757173	759784	758595	772199	780626	768004	768833	1.11

　　3.3 重現性實驗
　　將供試品 1、2、3、4、5進行平行測定，結果供試品中鹽酸小檗堿的平均含量為101.1%，鹽酸小檗堿峰面積RSD=0.616%，結果表明重現性良好。詳見表3。
　　表3 重現性實驗結果

樣品編號	1	2	3	4	5	Mean%	RSD%
峰面積	757450	745261	744832	759419	764157	101.1	0.616

　　3.4 精密度實驗
　　精密吸取鹽酸小檗堿對照品溶液10μL測定，連續進樣5次，測定峰面積，求得鹽酸小檗堿峰面積RSD=0.246%，表明精密度良好，詳見表4。
　　表4　 　精密度實驗結果

進樣次數	1	2	3	4	5	RSD%
峰面積	757173	757727	761599	759784	757652	0.246

　　4 討論
　　4.1實驗結果顯示：河南農大綠色飼料實驗室擬開發飼料添加劑中鹽酸小檗堿的含量為101.1%，為其進一步的開發為飼料添加劑提供參考依據。
　　4.2實驗中所采用的色譜條件是在張晶，楊朝蓮及劉建華的實驗條件下進行改進的一種新的條件。[7~9]
　　4.3實驗所采用的色譜條件，供試品與標準品保留時間基本一致，此方法穩定性、重現性和精密度均良好，可作為三顆針活性成分中鹽酸小檗堿含量的一種有效測定方法。
　　參考文獻
　　[1]王勤，馬志剛等.甘肅產三顆針植物中生物堿測定及分布狀況研究[J].分析測定學報2004,23(3):54-57.
　　[2]李亢宗，韓躍武.高效液相色譜法測定三顆針中生物堿的含量[J].蘭州醫學院學報，1994,20(1):1-2.
　　[3]廖志新，李玉林，紀蘭菊，孫洪發.青海產三顆針中鹽酸小檗堿的最佳提取工藝研究[J].天然產物研究與開發，1997,10(2)：62-65.
　　[4]王水晶，王洪福.從野生植物三顆針中提取黃連素[J].綿陽師范高等專科學校學報，2001,20(5)：43-47.
　　[5]張福維，關崇新，高坤.鹽酸小檗堿提取實驗的改進[J].大學化學，2003,18(4)：47-49.
　　[6]袁麗，戴云花，何迎春，楊宏健，肖美鳳.正交實驗優選三顆針中小檗堿的提取工藝[J].懷化醫專學報，2005,4(1)：34-36.
　　[7]張晶.HPLC法測定鹽酸小檗堿預混劑的含量[J].中國獸藥雜志，2006,40(7)：34-36.
　　[8]楊朝蓮，馮華，張運杰，武孔去，靳風云，梁光義.HPLC法測定三顆針中鹽酸小檗堿的含量[J].貴陽中醫學院學報，2005,27(3)：57-58.
　　[9]劉建華，王志祥，劉嶺.HPLC法測定中草藥飼料添加劑中鹽酸小檗堿含量[J].獸藥與飼料添加劑，2006,11(2)：29-30.

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