飼用酶檢測過程中非定義影響因素的分析

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　　飼用酶檢測過程中非定義影響因素的分析

　　湯海鷗 汪 勇 李富偉

　　Analysis of influence factors not included in definition during enzyme activity test
　　Tang Haiou, Wang Yong, Li Fuwei
　　飼用酶制劑是應用現代生物工程技術，選用特殊的微生物菌株經發酵產生的具有催化活性的生物制劑。近年來，因其具有改善畜禽消化道功能、降低食糜粘度和抗營養性、提高飼料利用率和減少環境污染等特點，已作為環保型飼料添加劑廣泛應用于畜牧業。但因飼用酶制劑應用開發較晚，當前飼用酶制劑酶活測定方法除了植酸酶外其它酶制劑都還沒有一個全國通用的標準方法。雖然隨著酶制劑工業的發展，酶活檢測水平已得到了相應的提高，對于酶活檢測中的一些重要因素人們在酶活定義中已經進行了明確的規定，例如其中的溫度、pH值、時間、底物等，并且對于這些因素在酶活測定過程中對結果的影響程度以及這些因素不同值下的對比關系，廣大科研工作者已經進行了大量而深入的研究。但是酶活檢測過程中除了這些定義中規定的因素對酶活檢測結果影響很大以外，許多非定義因素對酶活的檢測結果影響也極其顯著。因此，對于酶制劑酶活大小的判斷和對比，不能僅僅從定義中規定的因素進行分析，那些非定義因素的分析也至關重要。有鑒于此，筆者就酶制劑酶活測定中一些影響酶活測定值的非定義因素進行了分析，并對其中有些不確定的影響因素進行了對比試驗，以便為廣大的酶制劑應用者更好的把握酶制劑的質量提供參考。
　　1 緩沖液的配置
　　飼用酶制定義中的pH值的確定都是根據動物的胃腸內最佳作用pH值得來，一般在5.0～5.5左右。為了達到酶活定義所要求的pH值范圍，酶制劑檢測時都應用一定的緩沖液調配使反應體系達到相應的pH值。反應體系中緩沖液的離子強度影響酶制劑的蛋白空間結構，從而影響其催化能力，所以測定酶活時應盡可能統一反應緩沖液的種類和離子強度。但是在pH相同的條件下如果緩沖液的離子對和緩沖溶液的摩爾濃度不相同，則測定出來的酶活差別很大。乙酸緩沖液在酶制劑檢測中最常使用，但也有方法使用檸檬酸和硼酸等緩沖液。緩沖液摩爾濃度國內方法一般用0.1和0.2M的居多，在國外也有使用0.05M的方法。Nelson等(2007)試驗證明，使用檸檬酸緩沖液測定真菌性植酸酶的活性僅相當于使用乙酸緩沖液的65～70%。然而，在緩沖液使用上的差異并不對所有植酸酶都產生相同的影響。Dalsgaard等(2007)發現，乙酸緩沖液和檸檬酸緩沖液對兩種大腸桿菌植酸酶的相對酶活影響區別很大，用檸檬酸緩沖液分析得到的植酸酶活性只相當于用乙酸緩沖液的1/3左右。我們應用相同測定方法不同的兩種的緩沖液測定同一種木聚糖酶樣品，結果表明使用乙酸緩沖液測定的酶活僅相當于使用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液的60～70%。
　　2 底物的配置
　　底物的差別對酶活測定結果具有很大影響。底物的選擇最好應用酶制劑實際應用時所對應的酶解底物為好，但是在實際檢測時因為考慮到底物穩定性以及酶活檢測的方便性等問題，底物的性質和型號往往有很大的區別。對于沒有統一國標規定的測定方法，在底物的性質上存在許多不同，其中多以鹽的形式居多，例如纖維素酶的底物以用羧甲基纖維素鈉為多，但也有直接用微晶體纖維素進行測定的方法。即便是植酸酶的底物植酸鈉也存在不同種型號的情況，應用不同型號的植酸鈉進行測定，結果之間差別也很顯著。我們采用試驗的方式考察了不同pH條件下二種底物(SigmaP8810和P3168)檢測不同酶活水平的植酸酶時其檢測值之間的差別。結果表明：不同pH條件下，P8810與P3168的檢測結果之間差異都極顯著(見表1)。
　　表1 不同pH下三種底物對不同酶活水平的植酸酶檢測結果及分析

pH 底物

酶活水平(U/g)
　　1000 3000 5000 6000 7000 10000
　　5.5 P8810 1617±25 4158±10 5980±4 7670±141 10040±119 12795±100
　　P3168 1340±15 3181±77 5014±17 5903±50 8009±59 9790±150
　　5.0 P8810 1748±36 5384±53 6738±33 8559±101 10890±118 14508±130
　　P3168 1596±72 4508±26 6113±65 7498±43 9802±132 12621±227
　　因素 P值
　　底物 P3168(5.5,5.0) P8810(5.5,5.0) P=0.000
　　3. 顯色劑的配置
　　酶制劑檢測時其量的判斷一般都是通過試劑顯色來確定，并用不同的方式對比產物生成的量。顯色劑里同時配有使反應中止的試劑，使整個溶液起到顯色和中止的作用，一般顯色液的配置都比較復雜，例如植酸酶顯色劑釩鉬酸胺溶液、測定還原糖類用的顯色劑DNS(3,5-二硝基水楊酸)溶液等。其中，顯色劑類型的不同、相同顯色劑但其中物質配比的不同、顯色劑在反應中添加量的不同以及顯色時間的不同，都會產生不同的反應結果，對酶活檢測的值也會產生一定的影響。聶國興(2002)研究了DNS量對木聚糖酶活性測定的影響，結果表明：由于DNS用量變化，測定結果也發生了明顯變化，DNS用量在3ml時測得的酶活最高。王琳等(1998)研究DNS法測定纖維素酶活力最適條件，結果表明DNS顯色5分鐘比較適宜。DNS溶液的配置以3,5-二硝基水楊酸試劑為主，加入氫氧化鈉保持DNS的堿性環境并中止酶解反應，同時加入防止溶解氧侵入的酒石酸鉀鈉，還可能加入一些顏色穩定劑如亞硫酸鈉、苯酚等。我們應用試驗研究了添加和不添加試劑亞硫酸鈉、苯酚的DNS前后對比對酶活產生的影響，結果表明添加與不添加對比色的吸光值產生顯著影響，對酶活和穩定性影響不顯著。試驗研究DNS顯色時間不同和DNS添加量不同時木聚糖酶酶活變化趨勢，結果表明DNS顯色時間在5min添加量在3ml時最合適(見下圖1)。
　　圖1 DNS顯色時間不同和DNS添加量不同時木聚糖酶酶活變化趨勢
　　4 稀釋倍數
　　目前測定酶活的方法通常是先把酶稀釋，然后測定稀釋酶的活力，所得到的結果乘以稀釋倍數即為原酶的活力。但是，事實上許多酶的活力和稀釋倍數并不成比例關系。選擇酶樣的稀釋倍數實質上是選擇酶分子與底物分子之間的數量比例，二者的比例只有在適當的范圍內時酶蛋白的活力才與產物的生成量呈線性正比例關系。酶樣稀釋倍數過大會影響酶活的穩定性，稀釋倍數不同最終獲得的酶活測定值有很大差異。費笛波等(2004)為探討稀釋率對木聚糖酶測定結果的影響，將酶樣稀釋度從1000倍升至11000倍，結果表明，稀釋度的改變，明顯影響酶活力測定結果，稀釋度低，因吸光值太大使結果大大偏低;但稀釋度過大因A值過小，結果也偏低。筆者根據平時大量酶活測定應用性研究試驗發現，如果僅僅以吸光值的合理范圍(一般以0.2～0.5為宜)為稀釋依據，那么當稱取樣品的質量不同時，其測定的酶活值之間相差也非常大。所以，要想獲得相對穩定的測定結果，必須從合理吸光值范圍、最終稀釋液的濃度及稱樣量多方面考慮。
　　5 曲線的制作
　　標準曲線是酶制劑檢測過程中能求出檢測值的唯一對照依據，曲線方程的大小直接影響著換算出來的測定值。制作標準曲線時，要使得到方程的截距盡量小，R平方值盡量趨近于1，這樣才能更好的減小曲線的誤差對測定酶活值產生的影響。為了減少系統誤差給測定帶來的影響，標準曲線制作時應盡可能和樣品在同一條件下反應，標準品的選擇應盡量用純度較高的基準物或分析純品，標準品應注意保存防止吸水而對結果產生影響。標準曲線的制作一般可以采用相對法和絕對法兩種形式，相對法是借助已知準確含量的酶標準對照品作標準曲線，絕對法則是用一些酶活定義中規定的反應產物來衡量酶解產物作標準曲線，絕對法適用于法定的質量認證及仲裁機構，相對法適用于一般有日常測定需要的機構或企業。
　　6 小結
　　酶活測定是一種非常細致的工作，飼用酶制劑的檢測不僅是飼用酶推廣和應用的瓶頸技術之一，也是檢驗酶制劑產品的主要手段。在酶活檢測的過程中，不但要注意酶活定義中規定了的一些主要影響因素，很多非定義因素對酶制劑檢測也會產生很大的影響。同時檢測時的一些操作細節問題也應該注意，比如：離心速度、搖勻力度和次數、攪拌時間、移液器的正確使用以及玻璃儀器的清潔度等，這些細節可能不是酶制劑研究工作者非常關注和研究的焦點，但對于一些性質不穩定的酶制劑，這些細節問題的疏忽也會對結果產生較大的影響。所以，酶制劑檢測過程中應盡量把每一個要點和步驟做好。
　　參 考 文 獻
　　1 Nelson E. Ward, Donnie R.Campbell. Phytase activity expression requires understanding, FEED AND LIVESTOCK TECHNICAL BULLETIN.2007,9:10～15
　　2 NAKAMURA,T., SHITARA,A., MATSUDA,S and MASAHITO,M. Production, purification and properties of an endo-inulinase of Penicillium sp.TN-88 that liberates inulinase. J. Ferment. Bioeng., 1997,84(4):313～318
　　3 王琳,劉國生,王林嵩,張志宏,侯進懷,郭惠敏.DNS法測定纖維素酶活力最適條件研究.河南師范大學學報(自然科學版),1998,26(3):66～69
　　4 費笛波,馮觀泉,袁超.飼用木聚糖酶活性測定方法的研究.浙江農業學報,2004,16(2):53～58
　　5 聶國興,李春喜,張建新,溫建合,付艷茹.底物濃度、DNS量對木聚糖酶活性測定結果的影響.飼料工業,2002,23(11):24～25
　　6 陸文清,李德發. 影響飼料酶活力測定的因素分析.飼料研究,2002,(5):15～18
　　7 張若寒.植酸酶含量測定的必要性與兩步測定方法的評價.飼料工業,2001,22(9):1～5

donghaijun2009

拜讀全文，收藏起了。

saturnbio

好文章，收藏了！

鄭旭陽

關于檢測方法的文章,寫之前,最好自己要熟練操作, 看得出,作者熟悉實驗室操作.