米曲霉、黑曲霉發酵紅三葉草對異黃酮的影響研究

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　　米曲霉、黑曲霉發酵紅三葉草對異黃酮的影響研究
　　陳鳳風 成文曉 張福元
　　摘 要 本研究利用引進的產纖維素酶活高的米曲霉菌株1、2和黑曲霉3.3148，對紅三葉草固態發酵，通過比較不同菌發酵處理后酒精提取物在不同紫外波段吸光度曲線，研究了其對異黃酮結構的影響。結果表明：米曲霉菌株2對異黃酮結構有很大的破壞作用，而米曲霉菌株1和黑曲霉3.3148對其無影響。
　　關鍵詞 紅三葉 米曲霉、黑曲霉 異黃酮
　　紅三葉 (Red Clover)為豆科多年生草本植物，又名紅花苜蓿、紅菽草、紅荷蘭翹搖、金雀菜等，屬車軸草屬(TrifolIUm L.)[1]。紅三葉草原產于小亞西亞和西南歐，在歐洲各國及俄羅斯、澳大利亞、新西蘭、美國等國海洋性氣候地區廣泛栽培。紅三葉草在我國新疆、吉林、云貴高原、北鄂西山地都有野生，另外我國江淮流域、華北、華南、西南等地均有栽培，是一種優良的豆科牧草[2]。
　　紅三葉草主要含有異黃酮、維生素、氨基酸、糖類和等多種生物活性成分，其中異黃酮是紅三葉草中特殊的活性成分[3]。
　　異黃酮具有多種生理活性,概括起來主要有兩個方面：即植物雌激素功能和抗氧化功能[4、5、6]。
　　異黃酮在結構上與哺乳動物的雌激素——雌二醇相似,都具有雌激素的活性，它可與生物體內雌激素受體ER結合而表現出一定的雌激素功能。由于異黃酮活性組分與ER的結合力和甾體雌激素與ER的結合力相比低近千倍,因此,其結合后的潛在健康效應存在U型劑量-效應關系,即低劑量時由于它與雌激素競爭結合ER而降低了雌激素活性,因而表現為抗雌激素作用;而中劑量時可產生一定的雌激素活性;高劑量時,補充的異黃酮則可活化因雌激素水平限制而未能活化的ER,產生雌激素增強效應。這種U型劑量-效應關系使得異黃酮具有雌激素樣的多種功能[7、8、9、10]。
　　在生產中應用有顯著的效果：
　　(1).提高繁殖性能和提高泌乳性能，張榮慶和韓正康 [11]通過研究證實,大豆異黃酮可以顯著提高二花臉母豬在試驗初期的泌乳量。
　　(2).提高產蛋雞生產性能，劉燕強等[12]將320日齡羅曼蛋雞隨機均分為對照組,喂基礎日糧-和試驗組,基礎日糧中添喂大豆異黃酮 3mg/kg，結果試驗組產蛋率顯著提高，且蛋重和飼料轉化率也有所提高，表明大豆異黃酮可能通過調控血液激素水平而提高產蛋雞生產性能。馬學會[13]等研究：飼糧添加大豆黃酮可增加蛋殼厚度和蛋殼重，降低破蛋率，改善蛋殼品質。
　　(3).提高肉雞生產性能，郭曉紅等 [14]分別在肉仔雞日糧中添加大豆異黃酮5、10、15mg/kg,結果表明,添加大豆異黃酮可顯著增加肉公雞的平均體增重、飼料效率及平均日采食量。添加量為10mg/kg效果最好。飼料利用率和平均日采食量較對照組均顯著提高(P<0.05)。還有報道異黃酮能夠提高奶牛的產奶性能和肉牛的生長性能。因此，異黃酮可作為畜禽生長促進劑。后來的研究結果表明這類物質還具有強心、降血脂、對抗性激素依賴性腫瘤生長和抗癌等作用。鑒于此，我們利用米曲霉、黑曲霉固態發酵紅三葉草產高活性的纖維素酶的同時，首先有必要研究其對異黃酮的影響。
　　1.材料與儀器
　　1.1試驗材料
　　紅三葉草：購自甘肅岷海制藥有限公司，40目粉碎。
　　米曲霉菌株1：引自山西農大食品學院
　　米曲霉菌株2(Aspergillus oryzae var. effusus 3.2824)：購于中國普通微生物保藏管理中心
　　黑曲霉(Aspergillus.niger 3.3148) ：購于中國普通微生物保藏管理中心
　　鷹嘴豆素標準品：購于天津尖峰天然產物研究所
　　1.2儀器設備
　　生化培養箱：LRH-250A，廣東省醫療器械廠
　　高壓滅菌鍋：中國上海醫療器械廠
　　搖床：TZ-ZBH臺式恒溫振蕩器，北京沃德創意技貿有限責任公司(250mL三角瓶用)
　　超凈工作臺：北京東聯哈爾儀器制造公司
　　干燥箱：101-A型，上海實驗儀器總廠
　　電子天平：Adventurer OHAUS
　　植物粉碎機：江蘇省東臺市電器廠
　　電熱恒溫水浴鍋：江蘇省東臺市電器廠
　　紫外可見分光光度計：UV2100 尤尼克 上海儀器有限公司
　　500ml三角瓶、棉塞、牛皮紙等
　　2.實驗方法
　　2.1菌種的制備
　　馬鈴薯葡萄糖斜面試管培養基(PDA)
　　將馬鈴薯洗凈去皮,稱取200g,切成小塊,放入1000ml水中煮沸至土豆塊變軟,用紗布過濾，在濾液中加入稱好的20g瓊脂,不斷攪拌至瓊脂完全溶化,然后加入20g葡萄糖,攪拌至溶解,停止加熱補足水分至1000ml,分裝于試管,包裝,121℃高壓蒸汽滅菌30min，趁熱擺好斜面，備用。
　　將米曲霉菌株1、米曲霉菌株2、黑曲霉在超凈工作臺內接種于上述培養基，27℃恒溫培養至菌絲長滿試管，備用。
　　2.2紅三葉草發酵物的制備：
　　稱取20g紅三葉草粉于500ml三角瓶，加水40ml,攪勻，蓋好棉塞,外包牛皮紙，121℃高壓蒸汽滅菌45min。冷卻后于無菌條件下接2.1中備好的各菌種。每個菌種重復3瓶，于27℃培養至菌絲長滿2周后取出，干燥后40目粉碎待測。
　　2.3鷹嘴豆素標準物紫外吸收曲線圖的制作
　　精確稱取鷹嘴豆素5.2mg，用無水酒精定容于50ml容量瓶中。量取1ml于25ml容量瓶用無水酒精定容后，在230-300nm不同的波長測吸光度，得標準物鷹嘴豆素的吸收峰圖如下：
　　
　　Fig.1 The curve diagram of biochanin’s absorptance on different waveband
　　注：鷹嘴豆素在262nm處有最大吸收值
　　2.4紅三葉草和發酵基質酒精提取物不同波段吸收峰圖的制作：
　　準確稱取紅三葉干粉和經米曲霉菌株1、米曲霉菌株2、黑曲霉發酵后烘干物1g，裝于濾紙包內，置于索氏抽提管，用無水酒精90℃條件下提取完全，將索氏儀底部的圓瓶內提取物全部轉移到200ml容量瓶內，定容后在230-300nm測吸光值，制得酒精提取物在不同波段的吸光值曲線圖如下：
　　
　　Fig.2 The curve diagram of alcoholic extractions ’absorptance by different waweband
　　3 結果與分析
　　由圖2結合圖1知：紅三葉草無水酒精提取物在260nm處有最大吸收值，經黑曲霉3.3148、米曲霉菌株1發酵后的紅三葉酒精提取物在波長為260nm左右仍有最大吸收值，而且與未發酵紅三葉草酒精提取物的不同波段吸收曲線極為相似，可以推斷酒精提取物主要成分沒有變化，而經米曲霉2發酵的紅三葉的酒精提取物在250-270nm波段內沒有最大吸收值，其波段-吸光度曲線幾乎成為一直線，說明紅三葉草經米曲霉菌株2發酵后的酒精提取物成分發生了很大變化。結合舒淑等高效液相色普法檢測大豆異黃酮和陳封政等紅三葉中總異黃酮含量的測定的報道，酒精提取物內主要成分為異黃酮[34、35、36、37]，可以推斷米曲霉菌株2降解了紅三葉草內異黃酮。
　　4結論
　　米曲霉菌株2為米曲霉變種，雖然其產纖維素酶活高，但通過對紅三葉的發酵發現其不利于異黃酮的應用，因此選擇米曲霉菌株1、黑曲霉3.3148做進一步研究。
　　作者簡介：陳鳳風 成文曉，山西農大碩士研究方向：生物飼料工程
　　張福元：山西農大動物科技學院，教授

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