關(guān)于飼用酶制劑活性測定影響因素的分析

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　　關(guān)于飼用酶制劑活性測定影響因素的分析
　　摘 要：隨著飼用酶制劑的廣泛應(yīng)用，酶活的測定在飼用酶制劑產(chǎn)品的質(zhì)量檢驗(yàn)、產(chǎn)品標(biāo)簽和酶活保證方面變的必不可少。本文就影響飼用酶制劑活性測定的溫度、PH、作用時間、底物四大要素及非定義要素酶液稀釋度、標(biāo)準(zhǔn)曲線、顯色劑、緩沖液進(jìn)行了總結(jié)分析，以便為廣大酶制劑工作者正確的應(yīng)用酶制劑提供參考。
　　關(guān)鍵詞：酶制劑;酶活;測定;影響因素
　　飼用酶制劑是工業(yè)酶制劑的一個方面，飼用酶的使用已經(jīng)有50多年的歷史，但飼用酶制劑的快速發(fā)展期卻只是在最近的10～15年時間。近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，酶制劑的生產(chǎn)成本的日漸下降，越來越多的酶制劑被應(yīng)用在飼料工業(yè)中，發(fā)展到當(dāng)前已經(jīng)形成了龐大的飼用酶制劑市場，其中常用的飼料酶制劑主要有植酸酶、淀粉酶、蛋白酶和非淀粉多糖酶四大類。而隨著酶制劑生產(chǎn)發(fā)展的需要，酶制劑的檢測顯的越來越重要。經(jīng)過科研工作者多年的艱苦努力，我國飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中已經(jīng)確立了植酸酶、纖維素酶、β—葡聚糖酶的測定方法。另外，許多企事業(yè)單位為了生產(chǎn)研究的需要也制定了很多用于各種酶制劑活力的測定方法。
　　但是以化學(xué)方法檢測酶制劑的活性時存在許多變異因素，這些因素對不同酶制劑的影響不是平行和同步的，我們需要對酶制劑活性的檢測方法和檢測過程有一個正確的理解。因此，本文就飼用酶制劑活性測定影響因素進(jìn)行了總結(jié)分析，以便為廣大酶制劑工作者正確的應(yīng)用酶制劑提供參考。
　　1 影響飼用酶制劑活性測定的四大要素分析
　　所謂的酶活性都是指在特定的系統(tǒng)和條件下測到的反應(yīng)速度。為了確保酶制劑測定結(jié)果的一致性，飼用酶制劑活性單位定義中對影響酶活大小的主要條件進(jìn)行了規(guī)定，其中包括溫度、pH值、時間和底物，這些都是酶活力測定系統(tǒng)中最重要的因素，對酶促反應(yīng)速度影響很大。
　　1.1 溫度對酶活測定的影響
　　酶制劑對溫度非常敏感，在檢測過程中對溫度的控制則顯得非常重要。溫度對酶活性影響主要表現(xiàn)在兩個方面，一方面是當(dāng)溫度升高時，酶與底物的反應(yīng)速率加快;另一方面由于隨著溫度的升高將使酶的穩(wěn)定性下降，部分酶蛋白分子逐漸變性而失去活性，引起酶反應(yīng)速率下降;溫度的這兩種影響的綜合作用而產(chǎn)生酶反應(yīng)的“最適溫度”。對于不同的酶制劑在不同的情況下最適溫度是有一定的差別。研究木聚糖酶時發(fā)現(xiàn)，在30～40℃條件下酶活較穩(wěn)定，50℃后隨著溫度的升高，酶活力開始下降，90℃時基本失活(李衛(wèi)芬等，1999)。研究纖維素酶最適酶解條件時發(fā)現(xiàn)，在36～58℃之間纖維素酶相對酶活隨著溫度升高而升高，當(dāng)溫度在58～62℃之間時，相對酶活性沒有明顯變化，曲線近似呈水平狀態(tài)，在40℃、45℃、50℃條件下，其相對酶活分別為56%、70%、80%，而當(dāng)溫度大于58℃以上時相對酶活不再升高(王琳等，1998)。同時，酶在不同條件下適宜溫度也可能要受到酶的純度、底物、激活劑、抑制劑以及酶促反應(yīng)時間等因素的影響。
　　1.2 pH對酶活測定的影響
　　pH值在酶活測定時對測定結(jié)果影響很大，各種酶制劑在一定條件下都有其特定的最適酶解pH，酶的最適pH會隨著底物種類和濃度、緩沖液種類和濃度的不同而改變，因此最適pH也只有在一定條件下才有意義。pH影響酶活力的原因可能有以下幾個方面：1、過酸或過堿可以使酶的空間結(jié)構(gòu)破壞，引起酶構(gòu)象的改變，也影響酶活性部位催化基團(tuán)和結(jié)合基團(tuán)的解離狀態(tài)，酶活性喪失;2、當(dāng)pH改變不是很劇烈時，酶雖未變性，但酶活受到了影響。pH影響了底物的解離狀態(tài)，或者使底物不能和酶結(jié)合，或者結(jié)合后不能生成產(chǎn)物。pH影響酶分子活性部位上有關(guān)基團(tuán)的解離，從而影響與底物的結(jié)合或催化，使酶活性降低可能影響到中間絡(luò)合的解離狀態(tài)，不利于酶解生成產(chǎn)物;3、pH影響維持酶分子空間結(jié)構(gòu)的有關(guān)基團(tuán)解離，從而影響了酶活性部位的構(gòu)象，進(jìn)而影響酶的活性;4、pH影響底物的帶電狀態(tài)。這些都直接影響酶和底物的親和力，影響酶解反應(yīng)速度(王靜，2003;李險峰，2000)。文獻(xiàn)報道，很多酶的最適酶解pH都在3.0～6.0之間(NAKAMURA, T. 1997)。研究不同pH值對嗜熱毛殼菌木聚糖酶活性的影響發(fā)現(xiàn)，在pH值3.6以前，隨著pH值的增大，木聚糖酶的活性逐漸升高;pH值為3.6時，木聚糖酶的活性最高，且在3.2~4.4范圍內(nèi)木聚糖酶的活性維持較高濃度，維持嗜熱毛殼菌木聚糖酶活性的適宜的pH值范圍應(yīng)為3.2~4.4(王愛娜等，2006)。楊會濤等(2006)研究pH對木聚糖酶活性影響的結(jié)果表明，該酶的最適反應(yīng)pH為6.0。洪楓等(2000)在研究木聚糖酶最適pH值時指出，里氏木霉RutC-30合成的木聚糖酶最適pH值范圍在4.0～5.0之間，pH值對木聚糖酶的酶活影響很大。
　　1.3 作用時間對酶活測定的影響
　　酶催化反應(yīng)的動力學(xué)表明，酶解是一個有一定時間差的過程，當(dāng)酶解產(chǎn)物達(dá)到一定濃度后會對酶產(chǎn)生反饋抑制作用，因而反應(yīng)速度隨著時間延長會越來越慢，所以酶解并非酶解時間是越長越好。測定木聚糖酶酶促反應(yīng)開始至30 min內(nèi)的產(chǎn)物生成量，結(jié)果表明13 min內(nèi)產(chǎn)物的吸光度隨反應(yīng)時間幾乎呈線性增長，其斜率可以代表酶促反應(yīng)的初速度，此后速度減慢(單位時間內(nèi)產(chǎn)生的還原糖量呈下降趨勢)，相對酶活逐漸降低(費(fèi)笛波等，2004)。用DNS法測定纖維素酶活時反應(yīng)1min后，酶作用底物產(chǎn)生的還原糖量隨時間延長呈直線上升，5min后還原糖量的增加變得比較緩慢，10min后，曲線呈現(xiàn)水平狀態(tài)，還原糖量不再增加，往后隨著時間的延長相對酶活逐漸降低(王琳等，1998)。
　　1.4 底物對酶活測定的影響
　　底物的選擇對酶活的測定影響也很大。米氏方程表達(dá)了酶反應(yīng)速度與底物濃度之間的定量關(guān)系，其反應(yīng)方程式可表示為：E+S←→ES→P+E，首先酶(E)和底物(S)作用形成中間產(chǎn)物(ES)，然后形成產(chǎn)物(P)并釋放出酶(E)。在此平衡反應(yīng)中，底物(S)的濃度將影響反應(yīng)速度。當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時，底物濃度與酶活性成正比關(guān)系;當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥揭欢舛葧r，酶活將趨于一個極限值，這時酶已被底物所飽和，所以在測定酶活時，底物濃度應(yīng)大于這個極限值，這樣酶活性直接正比于酶濃度而與底物濃度無關(guān)，否則會極大地影響測定結(jié)果。研究底物濃度對木聚糖酶活性測定的影響結(jié)果表明：底物濃度對測定結(jié)果有較大影響，底物濃度越高，測定結(jié)果也越高;底物濃度在0.006～0.032g/ml時，酶活性的升高與底物濃度呈顯著正相關(guān);當(dāng)?shù)孜餄舛壬叩?.032g/ml以上時，酶活性隨底物濃度的升高幅度趨緩(聶國興等，2002)。研究底物對纖維素酶活性測定影響的結(jié)果表明，以Sigma產(chǎn)C5678為底物，纖維素酶活性測定值明顯高于上海產(chǎn)的羧甲基纖維素鈉測定值，且C5678濃度大于3%后，其濃度對纖維素酶活性測定值無明顯影響(顧賽紅等，2006)。
　　2 影響飼用酶制劑活性測定的非定義要素分析
　　在進(jìn)行酶制劑的檢測過程中，除了以上分析的幾點(diǎn)酶活定義中規(guī)定影響飼用酶制劑測定結(jié)果的因素外，酶活測定方法中還存在許多對酶活測定結(jié)果影響很大的非定義因素，這其中包括樣品酶的稀釋度、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作、顯色劑的配置、緩沖液的離子強(qiáng)度等。
　　2.1 酶液稀釋度對酶活測定的影響
　　測定酶樣時進(jìn)行稀釋可能帶來兩種效應(yīng)，一是影響酶的穩(wěn)定性，二是降低樣品中原有抑制因素和輔助因素的濃度。目前測定酶活的方法通常是先把酶稀釋，然后測定稀釋酶的活力，所得到的結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)即為原酶的活力。但是，事實(shí)上許多酶的活力和稀釋倍數(shù)并不成比例關(guān)系。據(jù)陸文清、李德發(fā)分析(2002)，選擇酶樣的稀釋倍數(shù)實(shí)質(zhì)上是選擇酶分子與底物分子之間的數(shù)量比例，二者的比例只有在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)時酶蛋白的活力才與產(chǎn)物的生成量呈線性正比例關(guān)系。酶樣稀釋倍數(shù)過大會影響酶活的穩(wěn)定性，稀釋倍數(shù)不同最終獲得的酶活測定值有很大差異(顧賽紅等，2006)。費(fèi)笛波等(2004)為探討稀釋率對木聚糖酶測定結(jié)果的影響，將酶樣稀釋度從1000倍升至11000倍，結(jié)果表明，稀釋度的改變，明顯影響酶活力測定結(jié)果，稀釋度低，因吸光值太大使結(jié)果大大偏低;但稀釋度過大因A值過小，結(jié)果也偏低。因此，測定時應(yīng)規(guī)定合理的吸光值范圍(以0.2～0.5為宜)，以獲得相對穩(wěn)定的測定結(jié)果。
　　2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線對酶活測定的影響
　　標(biāo)準(zhǔn)曲線是酶制劑檢測過程中能求出檢測值的唯一對照依據(jù)，曲線方程的大小直接影響著換算出來的測定值。為了減少系統(tǒng)誤差給測定帶來的影響，標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時應(yīng)盡可能和樣品在同一條件下反應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作一般可以采用相對法和絕對法兩種形式，相對法是借助已知準(zhǔn)確含量的酶標(biāo)準(zhǔn)對照品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，絕對法則是用一些酶活定義中規(guī)定的反應(yīng)產(chǎn)物來衡量酶解產(chǎn)物作標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對于絕對法，相對法測定結(jié)果精度高，速度快，費(fèi)用低。分析來自不同實(shí)驗(yàn)室的測定結(jié)果表明，兩種方法的精確度有近3倍的差異(張若寒，2001)。絕對法適用于法定的質(zhì)量認(rèn)證及仲裁機(jī)構(gòu)，為一般單位常規(guī)測定提供基準(zhǔn)物質(zhì)，相對法適用于一般有日常測定需要的機(jī)構(gòu)或企業(yè)。
　　2.3 顯色劑的配置對酶活測定的影響
　　在酶制劑檢測反應(yīng)的最后都要對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行顯色，并用不同的方式對比產(chǎn)物生成的量，一般應(yīng)用分光光度計法較多，也有用滴定法等其它方法。其中，顯色劑類型的不同、相同顯色劑但其中物質(zhì)配比的不同、顯色劑在反應(yīng)中添加量的不同以及顯色時間的不同，都會產(chǎn)生不同的反應(yīng)結(jié)果，對酶活檢測的值也會產(chǎn)生一定的影響。植酸酶酶活測定的機(jī)理都是利用酶水解植酸鈉底物形成無機(jī)磷，然后測定無機(jī)磷的釋放量，采用四種顯色方法對比測定植酸酶反應(yīng)產(chǎn)生的無機(jī)磷，分別是：丙酮—磷鉬酸銨法、釩—鉬酸銨法、維生素C —鉬藍(lán)法、鉬藍(lán)法，對比結(jié)果表明，丙酮—磷鉬酸銨法較其他三種方法更具有優(yōu)勢(黃遵錫等，1999)。聶國興(2002)研究了DNS量對木聚糖酶活性測定的影響，結(jié)果表明：由于DNS用量變化，測定結(jié)果也發(fā)生了明顯變化，DNS用量在3ml時測得的酶活最高。王琳等(1998)研究DNS法測定纖維素酶活力最適條件，結(jié)果表明DNS顯色5分鐘比較適宜。
　　2.4 緩沖液的離子強(qiáng)度對酶活測定的影響
　　反應(yīng)體系中緩沖液的離子強(qiáng)度影響酶制劑的蛋白空間結(jié)構(gòu)，從而影響其催化能力。所以，測定酶活時應(yīng)盡可能統(tǒng)一反應(yīng)緩沖液的種類和離子強(qiáng)度。研究植酸酶測定所用緩沖液時發(fā)現(xiàn)，使用檸檬酸緩沖液測定商業(yè)植酸酶(真菌植酸酶和細(xì)菌植酸酶)的酶活僅相對于使用乙酸緩沖液的65～70%(Nelson E. Ward等，2007)。Dalsgaard等(2007)發(fā)現(xiàn)，用檸檬酸緩沖液檢測兩種大腸桿菌植酸酶的酶活只相當(dāng)于用乙酸緩沖液得到的酶活的三分之一。
　　3 結(jié) 語
　　酶活的測定在飼用酶制劑產(chǎn)品的質(zhì)量檢驗(yàn)、產(chǎn)品標(biāo)簽和酶活保證方面是必不可少的。酶活測定是一種非常細(xì)致的工作，以上分析了一些影響酶制劑檢測的主要影響因素，但在酶制劑檢測的過程中，有些細(xì)節(jié)問題對酶制劑檢測也會產(chǎn)生一定的影響，比如：一些操作細(xì)節(jié)、離心速度、搖勻力度和次數(shù)、攪拌時間、移液器的正確使用以及玻璃儀器的清潔度等。這些細(xì)節(jié)可能不是酶制劑研究工作者非常關(guān)注和研究的焦點(diǎn)，但對一些性質(zhì)不穩(wěn)定的酶制劑進(jìn)行檢測時，這些細(xì)節(jié)問題的疏忽也會對結(jié)果產(chǎn)生較大的影響。所以，在飼用酶制劑酶活檢測過程中，我們不但要理解影響酶制劑酶活測定的主要因素，正確把握各影響因素的關(guān)鍵點(diǎn)，對于一些其它的細(xì)小影響因素也不能掉以輕心，盡量把酶制劑檢測過程中每一個要點(diǎn)和步驟做好。

lilyyang

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