不同制粒溫度下植酸酶活性的變化及畜禽飼養對比試驗研究

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　　不同制粒溫度下植酸酶活性的變化及畜禽飼養對比試驗研究

　　李富偉 湯海鷗 汪勇

　　摘要：試驗將含有制粒專用植酸酶制劑的日糧樣本在四種溫度條件下進行制粒，制粒后的飼料應用植酸酶國標法進行酶活測定，結果表明：制粒專用植酸酶在調制溫度70℃左右，蒸汽壓力不高的情況下酶活基本沒有喪失，酶活性能比較理想;當制粒溫度達到了80℃以上時，酶活出現明顯的降低，但總體都能保持在500U/Kg以上，制粒用植酸酶仍具有較好的耐熱性能。經過動物飼養試驗表明，肉雞和育肥豬飼養對照組和處理組之間的平均日增重和料肉比差異都不顯著(p>0.01)，這說明在添加制粒專用植酸酶后，對磷酸氫鈣的量進行調整并不會影響肉雞和育肥豬的生長性能，且同樣能達到普通植酸酶在粉狀飼料中的應用效果。
　　關鍵詞：制粒專用植酸酶;酶活;肉雞;育肥豬
　　Study on variations of Phytase Activity at Different Pelleting Temperature and Comparison Experiments on Pig and Poultry Feeding
　　Li Fuwei，Tang Haiou, Wang Yong
　　(Feed research institute of CAAS，Beijing Challenge Bio-technology Limited Company，Beijing，100081)
　　在日糧中添加植酸酶不僅可提高動物對植酸磷的利用率，而且還能降低磷在糞便中的排出量。但植酸酶為了達到功效必須在到達胃腸道時具有生物活性。由于飼料制粒機中蒸汽的加入和通過壓模機處理時的摩擦，提高了飼料溫度，使植酸酶的結構在熱的條件下易出現結構不穩定性[1]。但是隨著對植酸酶應用研究的不斷開展，在提高植酸酶耐熱性方面的研究工作目前已經得到長足的發展，從最初用固相載體穩定化處理酶發展到應用穩定劑結合包衣加工工藝，從基礎的菌種篩選到應用分子生物學誘變，這些技術很大程度上消除了逆性因子對飼用酶的破壞作用，使植酸酶能保持較高活力在畜禽體內發揮生物水解作用。本試驗就挑戰制粒專用植酸酶的在制粒過程中的酶活變化情況和在肉雞及育肥豬中的飼養效果進行研究，以便考察此酶的實際應用效果。
　　1 材料與方法
　　1.1 植酸酶
　　采用北京挑戰生物技術有限公司特節磷制粒專用植酸酶5000型，每克含植酸酶5000 U以上(樣品在底物濃度為5.0mmol/L、溫度37℃、pH值5.50的條件下，每分鐘從植酸鈉中釋放1mmol無機磷，即為一個植酸酶活性單位，以U表示)。
　　1.2 試驗動物
　　21日齡的艾維因肉雞;杜×長×大三元雜交豬。
　　1.3 試驗方法
　　1.3.1 制粒試驗
　　下表1是植酸酶添加到飼料時參數的設定，“條件一、二”設定對象是正常肉雞飼料，“條件三”是正常肉鴨飼料，“條件四”是正常育肥豬飼料。在設定的所有飼料制粒前加入挑戰特節磷制粒專用植酸酶120g，然后按照表1制粒條件進行實際的顆粒飼料生產，最后隨機收集四種條件下顆粒飼料樣品，對其進行植酸酶活性的檢測。
　　
　　1.3.2 飼養試驗
　　1.3.2.1 肉雞飼養試驗
　　選雞400只，按體重一致、公母各半原則隨機分為兩組，每組5重復，每重復40只。第一組為對照組，飼喂正常顆粒飼料，總磷含量為0.65%，第二組為處理組，按“條件二”情況進行飼料制粒，在對照組日糧基礎上減少氫鈣添加量0.7%，總磷含量為0.55%，添加石粉使鈣達到對照組水平，剩余空間用沸石粉補充，肉雞自由采食飲水，試驗期21天，試驗期間測定具體日增重和料肉比，結果應用SPSS軟件分析。具體配方和營養水平見表2：
　　
　　1.3.2.2 育肥豬飼養試驗
　　選用體重27.00±1.00 kg 的杜×長×大三元雜交豬42頭，每頭豬戴耳標，隨機分成對照組和試驗組，每組21頭豬，每組分3個重復組，每個重復組7頭豬。第一組為對照組，飼喂基礎日糧，總磷含量為0.65%，第二組為處理組，按“條件四”情況進行飼料制粒，在對照組日糧基礎上減少氫鈣添加量0.35%，總磷含量為0.56%，添加石粉使鈣達到對照組水平，剩余空間用沸石粉補充。試驗共55d，其中預飼期23 d，試驗期32 d。試驗期間測定具體日增重和料肉比，結果應用SPSS軟件分析。具體配方和營養水平見表3：
　　
　　1.4 植酸酶檢測方法
　　飼用植酸酶活性的測定——分光光度法(GB/T 18634—2002)[2]，每個試驗因子都同時作兩個平行兩個分解，結果以平均數±標準差表示。
　　2 結果與分析
　　2.1 制粒試驗結果
　　根據試驗設計方法，對制粒后飼料進行酶活測定，結果見表4：
　　
　　從試驗設計可以看出，在飼料中添加120克5000U/g的植酸酶，理論上顆粒中植酸酶含量應該為600U/Kg。但從結果可以看出，在“條件一”的環模壓縮比、調制溫度和蒸汽壓力三項參數值都比較低情況下，添加植酸酶的飼料經制粒后酶活卻達到了625±22 U/Kg，這比理論值還要高。分析其中原因可能有兩點：第一，為了確保產品的酶活含量在一些不理想的條件(如儲運溫度比較高、保存時間有些長等)下仍能達到標記值，生產植酸酶產品時的出廠酶活要高于5000U/g;第二，植酸酶測定是一種比較精細的工作，且受外界因素干擾比較厲害，測定可能會出現略微偏高的現象;所以制粒后的測定值略高于理論值屬于正常情況。同時從“條件一”的測定結果也可以說明，制粒專用植酸酶在調制溫度70℃左右，蒸汽壓力不高的情況下酶活基本沒有喪失，酶活性能比較理想。
　　對比“條件二、三、四”的測定結果，出現“條件三”的各項參數都比較高的情況下酶活值卻變大的情況，但與“條件二、四”測定值相對差值很小，理論分析其原因可能是由混合均勻度、試樣采集和酶活測定等誤差造成。三種條件下溫度都達到了80℃以上，蒸汽壓力都有所提高，而相對理論值酶活卻出現明顯的降低，但總體都能保持在500U/Kg以上，這也說明在80℃左右的制粒條件下該植酸酶仍具有較好的耐熱性能。
　　2.2 飼養試驗結果
　　2.2.1 肉雞飼養試驗結果
　　根據試驗設計測定飼養肉雞具體日增重和料肉比結果如下表5：
　　
　　注：同列數據肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.01)，下同。
　　從試驗結果可以看出，對照組和處理組之間的平均日增重和料肉比差異都不顯著。這說明在顆粒料中添加制粒專用植酸酶后，對磷酸氫鈣的量進行調整并不會影響肉雞的生長性能，且同樣能達到普通植酸酶在粉狀飼料中的應用效果。
　　2.2.2 育肥豬飼養試驗結果
　　根據試驗設計測定飼養育肥豬具體日增重和料肉比結果如下表6：
　　
　　從試驗結果可以看出，育肥豬的飼養結果對照組和處理組之間的平均日增重和料肉比差異同樣都不顯著，這也說明制粒專用植酸酶在育肥豬養殖上同樣具有很好的功效。
　　3 討論
　　3.1 制粒對植酸酶酶活性的影響
　　酶的化學本質是在氨基酸順序排列成一級結構的基礎上，通過二硫鍵、氫鍵、鹽鍵、疏水作用和靜電作用等化學力，再折迭成對活力發揮起關鍵作用的二、三級結構構象，而酶的穩定性就取決于酶是否以最小自由能的構象存在。在制粒的過程中，植酸酶既要承受干熱處理，又要承受濕熱的處理，植酸酶不僅吸收熱量導致構像發生變化，同時水分子和酶分子內氫鍵相互作用的破壞，使得植酸酶的構像更容易發生變化。但是，植酸酶作為生物催化劑在飼料工業上應用，不僅僅需要具有酶解植酸磷的作用，還應使植酸酶能達到工業制作對穩定性的要求。
　　因此，科研工作者們想盡辦法從多方面研究提高植酸酶耐高溫性能的方法。首先，從植酸酶生產的菌種出發，通過從極端環境中分離純化新菌種和進行人工改造菌種基因的方法獲得。香港大學的Tye AJ等(2002)從Bacillus subtilis 168和B.licheniformis中發現兩種新型熱穩定性的植酸酶，即使在Ca2+濃度很低、pH值中性的條件下，95℃保溫10min后仍能恢復80%的初始酶活[9]。Luis Pasamonts等(1997)將煙熏曲霉的熱穩定性植酸酶基因導入Asp.niger中，并在其中過量表達植酸酶，該植酸酶在100℃以下經過20分鐘，活性喪失10%，在90℃下120分鐘，仍有20%活性[10]。Pasamontes L等(2002)將Asp.fungi植酸酶基因與載體連接后再進行基因重組，結果得到的酶在90℃下處理80分鐘，活性仍保留40%[11]。Lutz Jermutus等(2000)利用A.niger的植酸酶基因，基于酶的二級結構原理在A.terreus的植酸酶表面進行離子交互作和氫鍵搭橋實現了分子酶定向進化，提高了酶的耐熱性[12]。
　　其次，從生產方式出發，通過包被和添加穩定劑的方式可以提高植酸酶的耐熱性能。蘇東海等(2004)考察了不同種類的糖、鹽及濃度在干熱及濕熱的情況下對植酸酶殘存酶活的影響，通過正交實驗得到包埋顆粒，其包埋率為82.8%，包埋后水分活度大于0.35時，包被酶在干熱的情況下殘存酶活比原酶有較大的提高，殘存酶活提高8.7%，濕熱的情況下，殘存酶活提高58.3%，胃蛋白酶對其的損壞作用也明顯減小[3]。Ha等研究一種新的熱穩定性的植酸酶部分或充分結合Ca2+時的晶體結構，也發現Ca2+對于該酶的活力和熱穩定性有重要作用。在Ca2+高親和力結合位點結合兩個Ca2+，連接酶分子氨基酸序列上的遠距環狀片段，該酶的熱穩定性顯著提高(使熱變性溫度提高了30℃)[13]。
　　3.2 制粒植酸酶在動物生長上的應用
　　目前，普通植酸酶產品經過多年的推廣應用，其在動物非高溫制粒飼料上使用功效已經得到了廣泛的證明[4,5,6]。而對于耐高溫植酸酶，如果在飼料制粒后仍能保持很好的活性，則其對動物的生產功效同樣應該會得到有效的發揮。從本研究可以初步證明，在添加耐高溫植酸酶產品的肉雞和育肥豬料經制粒后進行飼養試驗，肉雞和育肥豬的生產性能未出現顯著變化。何丹林等(2006)研究表明，以作正對照的含磷酸氫鈣1.60%的高鈣磷飼糧、作負對照的不含磷酸氫鈣的低鈣磷飼糧和在負對照飼糧中添加耐高溫植酸酶而得的植酸酶飼糧等三種能量蛋白水平相同的飼糧，對2日齡粵黃雞開展60d 的飼養試驗和屠宰試驗， 結果表明三組雞的軟腿率、死亡率和屠宰指標的差異均不顯著(P>0.05)，植酸酶組的生產性能與正對照的差異不顯著(P>0.05)，但顯著地高于負對照組的(P<0.05)，其中增重較負對照組的提高了11%[7]。目前，耐高溫植酸酶的開發應用已經得到了的快速發展[8]。相信隨著廣大科研工作的努力研究，耐高溫植酸酶產品必將會得到廣泛的開發和應用。
　　參考文獻：
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