嗜高溫酶及其耐熱機制

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　　除了核酶及脫氧核酶以外,其他酶的化學本質都是蛋白質。酶蛋白的一個重要性質就是遇熱變性并失去催化活性。可是有些酶能在80 ℃以上的條件下發揮功能,這類酶叫做嗜高溫酶。嗜高溫酶主要存在于嗜熱菌與超嗜熱古生菌中, 它們之所以能在70 ～
110 ℃的溫度范圍內生長,關鍵在于這類細菌的類脂、蛋白質、酶及核酸等生物大分子的熱穩定性。由于嗜高溫酶在高溫發酵、PCR 技術以及鉆井采油等方面具有廣泛的應用前景與開發潛力,所以研究它們的結構特點及其耐熱機制,尋找或設計新的嗜高溫酶是生產與科研共同關注的熱點問題。雖然現在還沒有徹底闡明嗜高溫酶的耐熱機制,但是從目前的研究結果來看,嗜高溫酶的抗熱性是由于酶本身穩定的天然結構以及嗜熱菌胞內含有的熱穩定因子對酶蛋白的保護作用。此外,鈣、鋅等金屬離子對嗜高溫酶也有熱穩定作用。
1 　嗜高溫酶的結構及其耐熱機制
由于早期地球是高熱缺氧的極端環境,故只有嗜熱的專性厭氧生物才能生存。超嗜熱古生菌的耐熱及專性厭氧等特點符合早期地球地質的化學條件,因此這類細菌很可能是地球早期的生命形式。如果生命開始于生存在熱環境中的嗜高溫微生物,進化過程則是使嗜高溫酶轉變成嗜常溫酶及嗜低溫酶。研究引起嗜高溫酶變化的因素,比較同源酶的結構差別,對于了解生命起源與進化,設計新酶以及認識嗜高溫酶的耐熱機制都會提供重要的啟示。
人們對嗜高溫酶和嗜常溫酶的氨基酸序列差異進行了大量的研究,發現大多數嗜高溫酶與同源嗜常溫酶的氨基酸序列同源性很大,只有某些關鍵區域少數氨基酸的變化,但也有些同源酶的氨基酸序列同源性較小,出現大量的氨基酸取代或插入。不管屬于哪種情況,酶蛋白的一級結構都對其本身的抗熱性具有重要作用。因為維持蛋白質高級結構的次級鍵(氫鍵、離子鍵及疏水鍵等) 都是由氨基酸序列中的側鏈基團參與形成的,故嗜高溫酶的一級結構改變就會引起這些次級鍵變化或者增加了次級鍵的數量,從而使酶分子的結構更穩定,因而也更具抗熱性。
Tesfay HS 分析比較了嗜熱脂肪芽孢桿菌( Bacil2lus stearothermophilus) 的熱穩定性3 - 磷酸甘油醛脫氫酶- GPDH - ST ( 80 ℃保溫10min 仍保持活性) 和Bacillus coagulans 的熱不穩定的3 - 磷酸甘油醛脫氫酶- GPDH - CO(55 ℃保溫5min 就失去95～100%的活性) 的氨基酸序列,這兩種酶都含有335 個氨基酸殘基,其序列同源性高達91. 6 %。這就暗示酶的耐熱性是由少數氨基酸的變化而引起的。GPDH - ST 與GPDH - CO 的氨基酸序列的差別體現在28 個氨基酸殘基上,它們主要分布在肽鏈中間的三分之一處。其中有5 個是GPDH - ST 中的脯氨酸代替了GPDH -CO 中的丙氨酸。脯氨酸的結構熵比其他氨基酸小且更容易折疊,但是一旦折疊就需要更多的能量才能解開。每個脯氨酸代替丙氨酸后能為折疊提供約1Kcal/mol 的自由能,故5 個脯氨酸代替的加合作用就極大地提高了酶的抗熱性。
由熱球菌( Thermcoccus litoralis ) 產生的Vent TMDNA 聚合酶和水生棲熱菌( Tnermus aqustics) 產生的Taq DNA 聚合酶都是嗜高溫酶。它們不僅為PCR 技術大量體外擴增DNA 提供了條件,而且也使PCR 技術得到了迅速發展與廣泛應用。將Taq 聚合酶的大片段( Klentaq1) 與大腸桿菌( Escherichia coli ) DNA 聚合酶I 的Klenow 片段( Klenow pol I) 進行比較,其序列同源性只有49. 6 %。進一步分析它們的結構后證明,兩·4 · 生物學教學2002 年(第27 卷)第4 期者C - 末端的折疊結構相似,而N - 末端的結構不同。Klentap1 N - 末端功能區的氨基酸序列與構象重排形成了一個疏水性更強的核心,同時消除了不利于熱穩定的靜電相互作用。其原因是Klentaq1 N - 末端功能區含有13 個脯氨酸,占總氨基酸數目的10 % ,大量地代替了Klenow pol I 中的丙氨酸。這種一級結構的變化使Klenraq1 中形成了一個富含脯氨酸的袢結構代替了Klenow Pol I 中的A 螺旋。Klenow Pol I 中的有靜電相互作用的殘基被Klentaq1 中的疏水或芳香殘基代替。盡管維持蛋白質三、四級結構的力有各種次級鍵,但是疏水力是最主要的力,故增加疏水有利于穩定酶蛋白的結構并提高了耐熱性。
現已從嗜高溫原生細菌( Pyrococcus f uriosus Pf ) 中分離出了紅氧還蛋白,醛鐵氧還蛋白及鐵氧還蛋白,并且測定了紅氧還蛋白和醛鐵氧還蛋白的晶體結構,確定了鐵氧還蛋白的二級結構。雖然因缺乏與之對應的嗜常溫酶而無法通過比較而得知醛鐵氧還蛋白在100 ℃時穩定的確切原因,但是通過比較與醛鐵氧還蛋白分子大小相近的30 種嗜常溫酶后發現,醛鐵氧還蛋白的表面積相對較小。說明它的分子結構比較緊密,同時這種形態可減少溶劑反應并增加酶的熱穩定性,嗜高溫細菌Thermotoga 的3 - 磷酸甘油醛脫氫酶與嗜常溫酶的分子大小相近且結構相似,可是表面積與體積的比也比較小。
由于酶的熱變性是因破壞次級鍵而引起構象破壞并失去生物活性的過程,故人們試圖通過研究嗜高溫酶的構象與次級鍵來了解其耐熱機制。到目前為止,還沒有發現嗜高溫酶中有維持構象的特殊鍵,只是這些鍵的數量與嗜常溫酶不同。Pf 的紅氧還蛋白和鐵氧還蛋白特別耐熱,在118～125 ℃時才發生熱變性。通過核磁共振與晶體結構圖分析表明,嗜高溫的紅氧還蛋白與已知的嗜常溫紅氧還蛋白的晶體結構很相似。
由此看來蛋白質的耐熱性不是因為總體結構的差別,而是與其分子表面幾個氨基酸的置換有關。與嗜常溫的鐵氧還蛋白相比,嗜高溫鐵氧還蛋白有三股β- 折疊而不是二股β- 折疊,還有較短的環,較長的α- 螺旋,在肽鏈兩端的氨基酸之間有特異的離子反應,這些反應有助于防止溫度升高引起的肽鏈末端開鏈并提高了酶的穩定性。
2 　熱穩定因子的保護作用
在體外,大多數有機溶劑可降低酶的熱穩定性或使酶變性失活,可是甘油、蔗糖及乙二醇溶液往往可增加酶的熱穩定性。在體內,超嗜熱古生菌通過代謝過程合成的高濃度的2 ,3 —二磷酸甘油酸可溶性物質對蛋白質、酶及核酸都有保護作用,可防止高熱條件下的變性失活過程。對于DNA 來說,它們還能合成與真核細胞組蛋白密切相關的DNA 結合蛋白。這種蛋白質與DNA 結合后能保護并防止DNA 在高溫條件下的解鏈變性過程。
超嗜熱古生菌中的熱網菌屬( Pyrodictium) 的細菌最高能在110 ℃的條件下生長。在這種溫度條件下,它們能合成占細胞蛋白質總量80 %的一種蛋白質。這種蛋白質具有兩種酶活性:一種是催化合成ATP 的活性,另一種是具有分子伴侶的活性。當環境溫度達到最高生長溫度并接近胞內蛋白質與酶的變性溫度時,這種分子伴侶通過重新折疊來保護其它蛋白質及酶對高熱的穩定性。但是在接近熱網菌的最適生長溫度105 ℃的100 ℃時,細胞僅合成少量分子伴侶。說明在一定溫度條件下,細菌能主動調節代謝并使合成分子伴侶的量隨著溫度的升高而增加。只有在最高生長溫度時才能合成大量的分子伴侶,用于保護蛋白質與酶的活性,從而使自身適應高溫環境。
3 　金屬離子
C2 +a 能提高許多熱穩定性酶的耐熱性。在C2 +a 存在的條件下,幾乎一半以上的堿性蛋白酶能在65 ℃的條件下維持15min。嗜高溫中性蛋白酶的熱穩定性更加依賴于C2 +a 。從云南西雙版納分離篩選的菌號為HY- 69 的耐熱菌株產生的含鈣中性蛋白酶特別耐熱,最適活性溫度為85 ℃,且80 ℃保溫3h 仍保持63 %的活性。如用透析法完全除去該酶中的C2 +a ,80 ℃保溫10min 就完全喪失活性。嗜熱菌蛋白酶( ther2molysin) 也是一種耐熱的含鈣中性蛋白酶。它含有4個C2 +a ,從酶分子中除去3 個或4 個C2 +a ,不影響酶的催化活性,但熱穩定性明顯降低。盡管還不了解C2 +a提高酶抗熱性的作用機制,但是推測C2 +a 對穩定酶分子的三維結構有重要作用。此外,鋅離子與鉀離子對某些耐熱酶也有熱穩定作用。根據嗜熱古生菌特殊的生活條件與地球生命起源初期的環境條件有許多相似之處,推測嗜常溫酶可能起源于同源的嗜高溫酶。隨著環境條件的變化,又迫于保持功能與自然選擇的壓力,因此在不影響功能的前提下,酶分子中可變區的氨基酸發生變化,致使構象與熱穩定性也發生變化,但是仍保持原來的功能。當然可能有其他的進化途徑。
    綜上所述,盡管人們對嗜高溫酶進行了大量的研究并取得了一些成果,但是還不足以說明嗜高溫酶的結構與耐熱機制之間的詳細關系,有許多問題還有待于進一步探討。相信隨著研究的不斷深入,會逐步加深了解嗜高溫酶的耐熱機制,同時也會為設計與表達新的嗜高溫基因重組酶提供理論依據。

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也就是說，如果我們的技術足夠發達的話，每一種酶都是可以改進成為耐熱的！