飼用植酸酶活性的測(cè)定——分光光度法》新舊國(guó)標(biāo)變化及解讀

牧馬祁連

由于植酸酶在配合飼料中的混合均勻度相對(duì)較差，飼料原料配方的復(fù)雜性、差異性會(huì)干擾添加植酸酶的配合飼料酶活檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度、精確度及穩(wěn)定性。5.5.3 對(duì)于加酶飼料樣品中酶的提取新標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定：“使用超聲波溶解器上超聲溶解15min，再放入回旋式振蕩器中振蕩30min。

從2009年10月1日起，GB/T 18634-2009《飼用植酸酶活性的測(cè)定——分光光度法》標(biāo)準(zhǔn)正式實(shí)施。 　　隨著植酸酶的大規(guī)模應(yīng)用，飼料企業(yè)如何選擇和鑒別植酸酶產(chǎn)品的問(wèn)題，已經(jīng)成為使用者的當(dāng)務(wù)之急。在眾多影響使用效果的因素中，產(chǎn)品本身的原因主要包括酶的種源、含量、溫度穩(wěn)定性、容重、pH特性及體內(nèi)水解效率等，其中酶活含量是最重要的質(zhì)量指標(biāo)。 　　GB/T 18634-2002《飼用植酸酶活性的測(cè)定——分光光度法》是在參考了AOAC方法的基礎(chǔ)上制定的，在國(guó)標(biāo)頒布之初，由于市場(chǎng)上的植酸酶菌種相對(duì)單一，國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法具有普遍的代表性，對(duì)植酸酶的生產(chǎn)、應(yīng)用和檢測(cè)起到了很好的指導(dǎo)作用。隨著植酸酶的逐漸普及，特別是在2004年以后，國(guó)內(nèi)對(duì)植酸酶的研究開(kāi)發(fā)進(jìn)展迅速，有大量采用不同菌種發(fā)酵的植酸酶相繼問(wèn)世，GB/T 18634-2002在檢測(cè)新型植酸酶產(chǎn)品上顯現(xiàn)出缺陷和不足，直接影響到檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。這次標(biāo)準(zhǔn)的修訂為植酸酶的制造、貿(mào)易、應(yīng)用甚至糾紛仲裁、以及加酶飼料的質(zhì)量控制和檢測(cè)方法的統(tǒng)一都提供了充分的依據(jù)，也是植酸酶發(fā)揮效果的基本前提。下面結(jié)合生產(chǎn)檢測(cè)實(shí)際 ，談?wù)勑屡f國(guó)標(biāo)的主要區(qū)別： 　　1 縮小了方法的適用范圍 　　新標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 18634-2009，以下同）適用范圍刪去原國(guó)標(biāo)（GB/T 18634-2002，以下同）中規(guī)定的“添加有植酸酶的濃縮飼料和添加劑預(yù)混合飼料”。修訂為：“本標(biāo)準(zhǔn)適用于飼料添加劑用植酸酶產(chǎn)品、也適用于添加有植酸酶的配合飼料”。 　　預(yù)混合飼料、濃縮飼料中金屬離子濃度高，成分復(fù)雜，對(duì)樣品干擾大，隨著樣品保存時(shí)間的延長(zhǎng)，酶的活性很不穩(wěn)定，用現(xiàn)行的提取條件不能將酶活提取完全，檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。因此，新國(guó)標(biāo)適用范圍中去掉了“添加劑預(yù)混合飼料、濃縮飼料”，保留“添加劑用植酸酶產(chǎn)品、配合飼料”。后兩類產(chǎn)品按照新標(biāo)準(zhǔn)的方法檢測(cè)均能達(dá)到較好結(jié)果。 　　2 調(diào)整了最低檢出限量和添加植酸酶的配合飼料樣品兩次試驗(yàn)的允許差 　　方法最低定量限由原標(biāo)準(zhǔn)的“90U/g”調(diào)整為“130U/g”。擴(kuò)大了添加植酸酶的配合飼料樣品兩次試驗(yàn)的允許差，由原標(biāo)準(zhǔn)的“≤10%”調(diào)整為“≤15%”。 　　由于植酸酶在配合飼料中的混合均勻度相對(duì)較差，飼料原料配方的復(fù)雜性、差異性會(huì)干擾添加植酸酶的配合飼料酶活檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度、精確度及穩(wěn)定性。盡管此次標(biāo)準(zhǔn)在最低檢出限量和試驗(yàn)允許差這兩方面做了調(diào)整，但并不能從根本上提高添加植酸酶配合飼料樣品酶活檢測(cè)的準(zhǔn)確度、精確度。實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)不同化驗(yàn)室間對(duì)添加植酸酶配合飼料中植酸酶檢測(cè)結(jié)果存在較大差別也是一種較為常見(jiàn)的現(xiàn)象。 　　3 刪除了相對(duì)法 　　原標(biāo)準(zhǔn)中絕對(duì)法是不借助中間物質(zhì)和步驟，直接使用烘至恒重的磷酸二氫鉀作為基準(zhǔn)物繪制工作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定植酸酶含量。但是方法本身先天的因素造成測(cè)定精度低。為了保證準(zhǔn)確度，必須加大測(cè)定的重復(fù)數(shù)，靠取平均數(shù)的辦法獲得可靠的測(cè)定值。所需時(shí)間長(zhǎng)，費(fèi)用高。絕對(duì)法適用于法定的質(zhì)量認(rèn)證及仲裁機(jī)構(gòu)標(biāo)定植酸酶標(biāo)準(zhǔn)品含量，為一般單位常規(guī)提供基準(zhǔn)物質(zhì)。相對(duì)法是借助已知準(zhǔn)確含量的植酸酶標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品作為工作標(biāo)準(zhǔn)曲線，間接獲得樣品的植酸酶含量。相對(duì)法結(jié)果的準(zhǔn)確性對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量的依賴性較大。其測(cè)定結(jié)果精度高，速度快，費(fèi)用低。高精確度是通過(guò)精確測(cè)定條件來(lái)達(dá)到的。適用于一般有日常測(cè)定需要的機(jī)構(gòu)、企業(yè)使用。由于精度高，減少了重復(fù)次數(shù)，可以增加同一測(cè)定批次的樣品數(shù)。兩種方法的根本區(qū)別就在于對(duì)照品不同。 　由于相對(duì)法使用的植酸酶標(biāo)準(zhǔn)品不易確定和不易采購(gòu)，新標(biāo)準(zhǔn)刪除了相對(duì)法，但由于絕對(duì)法對(duì)環(huán)境、設(shè)備條件要求較高，為了降低不同化驗(yàn)室間檢測(cè)結(jié)果的誤差，必須使用新標(biāo)準(zhǔn)8.2.2中的建議：“在測(cè)定樣品時(shí)附加一個(gè)已知活性的植酸酶參考樣，便于檢驗(yàn)整個(gè)操作過(guò)程是否有偏差。”對(duì)于在國(guó)內(nèi)使用的植酸酶參考樣應(yīng)在獲得國(guó)家權(quán)威質(zhì)量監(jiān)督部門授權(quán)的國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)室間進(jìn)行重復(fù)測(cè)定；如果是在國(guó)際范圍使用的植酸酶參考樣，則要在不同國(guó)家的權(quán)威實(shí)驗(yàn)室間進(jìn)行重復(fù)測(cè)定。 　　4 改變了緩沖溶液的配制方法 　　4.1 標(biāo)準(zhǔn)中使用無(wú)水乙酸鈉代替原標(biāo)準(zhǔn)中的三水乙酸鈉 　　4.2 用曲拉通X-100和牛血清白蛋白代替吐溫20做為增溶劑 　　因吐溫20只對(duì)少數(shù)一兩類特定的植酸酶浸提效果較好，但由于目前市場(chǎng)銷售的植酸酶菌種和生產(chǎn)工藝的不同，各單位檢測(cè)中使用的玻璃器皿質(zhì)量的不同等原因，使得大部分植酸酶使用吐溫20增溶效果較差，檢測(cè)中部分植酸酶會(huì)附著在容量瓶和試管壁上，因此，用曲拉通X-100和牛血清白蛋白（BSA）代替吐溫20作為增溶劑配制緩沖液，檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性較好。 　　5 其他區(qū)別：細(xì)化了測(cè)定過(guò)程中的操作步驟 　　5.1 明確了植酸鈉的相對(duì)分子質(zhì)量和純度，細(xì)化了溶液的配置 　　底物溶液的配制中新標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：先用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值5.5±0.01后，再定容。以上步驟有效確保了植酸酶酶活定義規(guī)定的植酸鈉濃度為5.0 mmol/L和pH為5.5的反應(yīng)條件。 　　5.2 緩沖液和植酸鈉溶液pH調(diào)節(jié)由原標(biāo)準(zhǔn)中使用“鹽酸調(diào)節(jié)”修訂為使用“冰乙酸調(diào)節(jié)” 　　5.3 細(xì)化了試樣的制備 　　新標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)固體樣品和液體樣品分別進(jìn)行了描述。 　　5.4 對(duì)制做標(biāo)準(zhǔn)曲線的稀釋順序進(jìn)行了調(diào)整 　　新標(biāo)準(zhǔn)中標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制使用了由低向高進(jìn)行配制的方法，更好的確保標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的準(zhǔn)確性。 　　5.5 細(xì)化了試樣溶液的制備過(guò)程 　　5.5.1 新標(biāo)準(zhǔn)對(duì)酶制劑樣品中酶的提取和加酶飼料樣品中酶的提取分別進(jìn)行了描述。 　　5.5.2 原標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)于酶制劑樣品中酶的提取僅使用“在磁力攪拌器中高速攪拌30min”提取方式，新標(biāo)準(zhǔn)增加了酶提取的新方案：“超聲波溶解器上超聲溶解15min，再放入回旋式振蕩器中振蕩30min。”用這兩種提取方式均可達(dá)到檢測(cè)要求。 5.5.3 對(duì)于加酶飼料樣品中酶的提取新標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定：“使用超聲波溶解器上超聲溶解15min，再放入回旋式振蕩器中振蕩30min。” 　　5.5.4 在使用磁力攪拌器進(jìn)行提取的方式中，新標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了“先定容再放磁力棒”的操作順序。此方法確保了試樣濃度的準(zhǔn)確性。 　　這次標(biāo)準(zhǔn)的修訂充分說(shuō)明了行業(yè)主管部門對(duì)植酸酶質(zhì)量監(jiān)督的高度重視 ，也是為了適應(yīng)當(dāng)前植酸酶行業(yè)出現(xiàn)的新發(fā)展，更好地維護(hù)廣大消費(fèi)者的權(quán)益，對(duì)植酸酶生產(chǎn)企業(yè)來(lái)說(shuō)則有利于實(shí)現(xiàn)公平競(jìng)爭(zhēng)條件下的優(yōu)勝劣汰。新標(biāo)準(zhǔn)的出臺(tái)為更科學(xué)地評(píng)價(jià)、檢測(cè)和使用植酸酶提供了較好的指導(dǎo)作用。

zhou7550

這個(gè)復(fù)制下載學(xué)習(xí)了，謝謝樓主解讀