豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌毒素、外膜脂蛋白的表達及重組蛋白的純化

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摘　要：將構建保存的重組表達質粒pETApxⅠA、pETApxⅢA和pPRoAppOML1用IPTG誘導表達，選擇最佳的表達條件為IPTG 1.0 mmol/L，溫　　摘　要：將構建保存的重組表達質粒pET-ApxⅠA、pET-ApxⅢA和pPRoAppOML-1用IPTG誘導表達，選擇最佳的表達條件為IPTG 1.0 mmol/L，溫度為37 ℃，表達時間為8 h，表達產物用SDS-PAGE鑒定，分別表達41、41、45 ku的蛋白，與預期蛋白大小一致。將表達產物用試劑盒進行純化，得到較好的目的條帶，并對其進行Western blot檢測，經過分析，pET-ApxⅠA、pET-ApxⅢA表達產物具有較好的免疫反應性。
　　關鍵詞：豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌；表達；純化；免疫反應性
　　豬傳染性胸膜肺炎是一種高度接觸傳染致死性呼吸道傳染病。急性和亞急性病例以纖維素性出血性胸膜肺炎，慢性病例以纖維素性壞死性胸膜肺炎為主要特征[1]。近年來隨著養豬業規模化、集約化的發展，本病的發生呈暴發趨勢，對養豬業的危害日益嚴重。
　　本病病原為胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropeumoniae，App）。其毒力因子為主要的免疫原。App有很多毒力因子可以引起豬致病，包括莢膜多糖、脂多糖、外膜蛋白（Outer memberanc protein，Omp）、轉鐵結合蛋白、蛋白酶、滲透因子及溶血素等[2]。有人對上述毒力因子及其免疫原性進行分析，發現溶血毒素、外膜蛋白在胸膜肺炎發生過程中扮演著更為重要的角色，也是主要的免疫原性物質[3-6]。
　　在App的15個血清型中共發現了4種不同的Apx溶血素，即ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ。Apx Ⅰ具有很強的溶血活性，它對肺泡巨噬細胞和中性粒細胞也具有很強的細胞毒性作用。而ApxⅢ與ApxⅠ和ApxⅡ的差異較大[4]，它對熱穩定，具有很強的細胞毒性，但卻沒有溶血活性。研究表明，ApxⅢ對豬肺泡巨噬細胞和中性粒細胞有很強的殺傷力，可嚴重破壞豬肺部非特異性細胞防御體系。它們都是胸膜肺炎放線桿菌的毒力因子，也是重要的保護性抗原[5]。Omp是胸膜肺炎放線桿菌的另一個重要毒力因子，針對Omp的抗體具有調理活性，所以Omp也是App的一種重要保護性抗原[6]。由此對毒素pET- ApxⅠA、pET-ApxⅢA、pPRoAppOML-1進行了表達及重組蛋白的純化。
　　1　材料與方法
　　1.1　菌株及質粒
　　重組表達質粒pET-ApxⅠA、pET-ApxⅢA和pPRoAppOML-1由本實驗室構建并保存。
　　1.2　主要試劑
　　異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、鹽酸胍（guanidine hydrochloride）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、聚乙二醇（PEG1500）、二硫蘇糖醇（DTT）、甘氨酸（Glycine）、尿素等購自BBI公司；低分子質量標準蛋白購自Promega公司；丙烯酰胺溶液（29∶1）儲存液、Trion-X 100、Tween-20、過硫酸銨（APS）、四甲基二乙胺（TEMED）、硝酸纖維素膜（NC膜）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、月桂肌氨酸、20×PBS濃縮液、氨基黑等購自上海生工生物工程技術服務有限公司；豬傳染性胸膜肺炎陽性血清由本實驗室制備；辣根過氧化物酶標記兔抗豬IgG（HRP-IgG）購自Gibco公司；二氨基聯苯胺（DAB）、牛血清白蛋白（BSA）、氯化鈷購自Sigma公司；其余試劑均為國產分析純。
　　1.3　重組菌的誘導表達
　　將本實驗室保存的重組質粒pET-ApxⅠA、pET-ApxⅢA轉入大腸埃希菌JM109（DE3），然后將其涂布于含有卡那霉素（100 μg/mL）的LB培養基上，37 ℃培養18 h后可挑取單菌落劃線培養，再接入5 mL LB培養基中，于37 ℃以220 r/min搖菌培養6 h～8 h后，用0.5 mmol/L～1.0 mmol/L IPTG誘導表達，在同樣條件下繼續培養約8 h。
　　同時將本實驗室保存的pPRoAppOml-1轉入大腸埃希菌JM109（DE3），然后將其涂布于含有氨卞霉素（100 μg/mL）的LB培養基上，37 ℃培養18 h后可挑取單菌落劃線培養，再接入5 mL LB培養基中，于37 ℃以220 r/min搖菌培養6 h～8 h后，用0.5 mmol/L～1.0 mmol/L IPTG誘導表達，在同樣條件下繼續培養約8 h。
　　1.4　表達產物的SDS-PAGE鑒定
　　按照分子克隆書中所介紹的方法進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），以鑒定表達產物的相對分子質量和表達量，同時用僅轉入空載體的全菌菌體蛋白液作為陰性對照。
　　1.5　重組蛋白的提純及復性
　　1.5.1　包涵體的純化
　　將誘導表達的重組菌收集、離心、洗滌后，重懸于PBS中進行超聲破碎，從細胞裂解物中提取包涵體，裂解包涵體并進行重組蛋白的純化和復性。
　　1.5.1.1　包涵體的提取和初純
　　①收集誘導表達的重組菌全菌液，于4 ℃以7 500 r/min離心10 min，棄上清；②分別用去離子水和冰冷的1×PBS（pH 7.4）洗滌菌體沉淀各一次，每次于4 ℃以7 500 r/min離心10 min，棄上清；③按5 mL PBS/100 mL原菌液量重懸菌體沉淀，4 ℃作用30 min后置于冰上進行超聲波破碎（250 W，脈沖5 s，間隔5 s，作用溫度4 ℃，處理10 min～15 min。處理應以不產生泡沫、尖銳刺耳聲和菌液成半透明為度），置－20 ℃凍存數小時，再次進行超聲波破碎（同上述條件）；④超聲破碎2次后，于4 ℃以7 500 r/min離心10 min，棄上清，所得沉淀即為包涵體；⑤用細胞裂解液Ⅱ洗滌所得包涵體2次～3次，去離子水洗滌1次～2次，置于－20 ℃備用。
　　1.5.1.2　包涵體的純化　由于包涵體的純化使用鎳柱親和層析（柱料為Ni-NTA His·Bind Resins），所以選用了pET-28a表達載體，以便在鎳柱純化時利用組氨酸標簽的作用純化出所需要的蛋白。采用鎳親和層析試劑盒變性條件下的純化包涵體方法，按照試劑盒說明書的步驟和方法進行柱料的再生。
　　1.5.1.3　包涵體純化物的復性　按蛋白復性試劑盒說明書操作，進行復性。
　　1.6　表達產物的Western blot分析
　　以標準蛋白分子質量為參照，進行標準蛋白分子質量、pET-APXⅠA、pET-APXⅢA、pPRocAppOml-1表達產物的SDS-PAGE電泳。電泳結束后進行Western blot分析。
　　2　結果
　　2.1　重組蛋白的鑒定
　　2.1.1　SDS-PAGE鑒定　重組表達菌經IPTG誘導表達后分別產生約41、41、45ku大小的表達條帶，與預期蛋白大小基本相符，而pET-28a空載體轉化對照菌的誘導表達產物無此表達帶，初步表明重組表達菌表達產物為目的重組蛋白（圖1，圖2）。
　　2.1.2　包涵體純化物的鑒定
　　結果見圖3。
　　1.IPTG誘導的pET-28a產物；2～6. IPTG誘導的分別在2、4、6、8、10 h pET- ApxⅠA的產物；7～11.IPTG誘導的分別在2、4、6、8、10 h pPRoAppOml-1的產物；M1，M2.蛋白分子質量標準
　　1.pET-28a products induced with IPTG；2-6.pET-ApxⅠA products inducedin 2,4,6,8,10 h with IPTG；7-11.pPRoAppOml-1 products induced in 2,4,6,8,10 hwith IPTG；M1，M2.Protein Marker
　　圖1　pET- ApxⅠA和PPRoAppOml-1重組菌表達產物的SDS-PAGE
　　Fig.1　SDS-PAGE of expression products ofpET-ApxⅠand pPRoAppOml-1
　　1.IPTG誘導的pET28a產物；2～5. IPTG誘導的pET-ApxⅢA分別在2、4、6、8、10 h的產物；M.蛋白分子質量標準
　　1.pET-28a products induced with IPTG；2-5.pET-ApxⅠA products induced in 2,4,6,8,10 h with IPTG；M.Protein Marker
　　圖2　pET- ApxⅢA重組菌表達產物的SDS-PAGE
　　Fig 2　SDS-PAGE of expression products of pET- ApxⅢA
　　1、4、6.分別為IPTG誘導的pET-APXⅠA、pPRoAppOml-1、pET-APXⅢA產物；M.蛋白分子質量標準；2、5、7.分別為pET-APXⅠA、pPRoAppOml-1、pET-APXⅢA純化后產物
　　1,4,6.pET-APXⅠA，pPRoAppOml-1 and pET-APXⅢA products induced with IPTG；M.Protein Marker；2,5,7.Purified pET-APXⅠA，pPRoAppOML-1 and pET-APXⅢA expression products
　　圖3　純化的重組菌表達產物的SDS-PAGE
　　Fig.3　SDS-PAGE of purified expression products of therecombinant bacteria
　　從圖3可以看出，在純化之后，雜帶明顯減少，包涵體的純度得到了顯著的提高。
　　2.1.3　Western blot分析　結果顯示（圖4），重組菌表達產物中的蛋白條帶可被豬傳染性胸膜肺炎陽性血清識別。證明已獲得重組蛋白的準確表達。
　　M.蛋白分子質量標準；1～3.分別為IPTG誘導的pET- ApxⅠA、pPRoAppOml-1、pET- APXⅢA產物
　　M. Protein Maker；1-3.pET-APXⅠA，pPRoAppOml-1 and pET- APXⅢA expressionproducts with IPTG
　　圖4　表達產物的Western blot分析
　　Fig.4　Western blot analysis of the expression products
　　3　討論
　　3.1　App是一種多毒力因子的條件致病菌，其致病因子及其致病機理非常復雜。我們對其相關毒素基因構建好的重組質粒進行了表達，對其表達條件進行了摸索，經過試驗對誘導劑的濃度和表達溫度進行了選擇，最終確定了最佳的表達條件，
　　IPTG誘導最適終濃度為1.0 mmol/L，誘導最適溫度選擇為37 ℃，誘導時間最佳為8 h。這為以后的純化作了很好的鋪墊，是蛋白純化得以順利進行。
　　3.2　本試驗所表達的產物為包涵體形式，包涵體是蛋白質聚集而成的致密顆粒，分離的第一步是對培養收集的細胞進行破碎。收集到的包涵體沉淀需用去污劑（Triton X-100或脫氧膽酸鈉）和低濃度變性劑（2 mol/L尿素或鹽酸胍等）洗滌除去脂類和膜蛋白[7]，這一步很重要，否則會導致包涵體溶解和復性的過程中重組蛋白質的降解。所以試驗采用的是反復凍融細胞并結合超聲波處理來裂解細胞，由于超聲處理過程容易產生熱量集中，造成蛋白碳化，選擇在冰上超聲，并采用一定的時間間隔，延長超聲處理時間使包涵體蛋白徹底釋放，沉淀下來，與可溶性蛋白分離，從而獲得包涵體。經過純化，得到比較理想的產物條帶，但是，其量比較小，所以在以后的工作中還需要進一步的摸索條件。
　　3.3　純化產物經過Western blot分析均有較好的免疫反應性，這些工作和結果為進一步研究新型亞單位疫苗和診斷試劑奠定了良好的基礎。