飼料摻假原料中非蛋白氮的快速檢測(cè)方法探討

007畜牧

　

　摘  要：本文主要探究飼料摻假原料中主要幾種非蛋白氮的快速定性檢測(cè)方法，包括尿素、銨鹽、硝酸鹽-亞硝酸鹽、尿醛聚合物、生物蛋白精、三聚氰胺的快速定性檢測(cè)。快速定性檢測(cè)方法在實(shí)際原料摻假檢測(cè)工作中與其標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法比較更簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、結(jié)果直觀、選擇性強(qiáng)，是一種實(shí)用性強(qiáng)、易推廣的飼料摻假原料中非蛋白氮的檢測(cè)方法。
　　關(guān)鍵詞：非蛋白氮；尿素；銨鹽；硝酸鹽-亞硝酸鹽；尿醛聚合物；生物蛋白精；三聚氰胺
　　飼料是發(fā)展畜牧業(yè)的物質(zhì)基礎(chǔ)，飼料中所含的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及有害物質(zhì)直接影響畜禽產(chǎn)品的質(zhì)量，進(jìn)而影響人類健康。近年來(lái)， 由于對(duì)原料的使用處理不當(dāng)，二噁英、瘦肉精、蘇丹紅等由飼料安全問(wèn)題引發(fā)的畜產(chǎn)品安全問(wèn)題不斷出現(xiàn)，已成為全球性關(guān)注的社會(huì)和政治問(wèn)題，因而飼料原料的檢驗(yàn)工序已是飼料生產(chǎn)中的重要程序。實(shí)驗(yàn)以大量的生產(chǎn)實(shí)踐為基礎(chǔ)，探究出更為實(shí)用、簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的測(cè)定飼料原料中非蛋白氮的檢測(cè)方法，為以后飼料檢測(cè)水平的改進(jìn)提供理論依據(jù)。
　


　1 檢測(cè)方法
　　對(duì)部分樣品進(jìn)行脫脂，脫脂有兩種方法，包括慢速脫脂和快速脫脂。
　　慢速脫脂：粗稱取樣品10g，把樣品用濾紙包好，把濾紙包放入燒杯并加入石油醚，浸泡脫脂2～3h。然后取出濾紙包，將濾紙包放入通風(fēng)櫥中，把石油醚揮發(fā)干凈。
　　快速脫脂：粗稱取樣品10g，把樣品直接放入一個(gè)100mL小燒杯中，加30～40mL石油醚浸沒(méi)樣品，充分?jǐn)嚢瑁葺腿?5min左右。然后把上清液倒掉，用濾紙過(guò)濾，收集脫脂樣品。把脫脂樣品放通風(fēng)櫥中，使石油醚揮發(fā)干凈。
　　1.1 尿素、銨鹽、硝酸鹽-亞硝酸鹽的快速定性檢測(cè)
　　粗稱2g上述脫脂樣品于試管中，加10mL蒸餾水，用渦旋混合器混合10～15s，靜置10min，取用上清液測(cè)非蛋白氮。
　　1.1.1 尿素的快速定性檢測(cè)
　　尿素是一種白色、易潮解的結(jié)晶固體，純尿素含氮量為46.6%（折合粗蛋白質(zhì)含量291.3%）。這是最簡(jiǎn)單的非蛋白氮類化合物。是生產(chǎn)中使用范圍最廣、時(shí)間最長(zhǎng)、用量最大的一種非蛋白氮。1kg尿素相當(dāng)于2.88kg粗蛋白質(zhì)，相當(dāng)于7kg大豆餅。
　　快速檢測(cè)尿素有兩種方法。
　　第1種方法：先加6～8滴上清液到白色點(diǎn)滴板上，然后加2～3滴0.1%溴百里酚蘭和4～5滴0.4%尿素酶到白色點(diǎn)滴板上，觀察顏色變化情況。若為陽(yáng)性反應(yīng)結(jié)果呈藍(lán)色，陽(yáng)性最低檢測(cè)限是0.25%。
　　第2種方法：取試樣5g左右，置于一張干凈的濾紙上，再加入5g左右的生豆粉，攪拌均勻，用蒸餾水潤(rùn)濕，滴入數(shù)滴甲酚紅試劑，讓其反應(yīng)3～5min，若有尿素存在即顯出紅色，且散開(kāi)得像蜘蛛網(wǎng)似的，無(wú)尿素則顯出黃色。
　　1.1.2 銨鹽快速定性檢測(cè)
　　加6～8滴上清液到點(diǎn)滴板上，然后滴加2～3滴奈斯勒試劑，觀察顏色變化結(jié)果。陽(yáng)性反應(yīng)的結(jié)果：開(kāi)始為黃色，逐漸變?yōu)樯罱凵粫?huì)就變灰色，若只出現(xiàn)深桔色、基本不變色或由黃色直接變?yōu)榛疑蚝芸熳優(yōu)榛疑瑒t是陰性。最低檢測(cè)限是0.1%。
　　1.1.3 硝酸鹽-亞硝酸鹽的快速定性檢測(cè)
　　加6～8滴上清液到點(diǎn)滴板上，然后加2～3滴0.5%二苯胺，觀察顏色變化結(jié)果。陽(yáng)性反應(yīng)的結(jié)果：在點(diǎn)滴板中間是深藍(lán)色，最低檢測(cè)限是0.05%。
　　1.2 脲醛聚合物的快速定性檢測(cè)
　　快速檢測(cè)脲醛聚合物有兩種方法。
　　第1種方法適用范圍：動(dòng)物性原料和植物性原料
　　動(dòng)物性原料脫脂（植物性原料不用脫脂）， 樣品過(guò)45目篩， 加6～8滴0.5%變色酸到點(diǎn)滴板上， 取一些篩下樣品也加到點(diǎn)滴板上，往點(diǎn)滴板上再加0.5%變色酸，觀察顏色變化結(jié)果。陽(yáng)性反應(yīng)的結(jié)果：在5～10min內(nèi)，出現(xiàn)藍(lán)紫色，最低檢測(cè)限是0.15%。
　　第2種方法適用范圍：僅動(dòng)物性原料
　　稱3g樣品加到50mL帶蓋離心管中，加35mL煮沸的20% NaOH溶液，用渦旋混合器混勻，靜置大約5min，倒掉上清液，留下底部沉淀，加35mL蒸餾水，混合，靜置5min，倒掉上清液，反復(fù)洗3～4次，洗到沉淀無(wú)色（白到灰色），用蒸餾水將沉淀轉(zhuǎn)移到10mL的試管中，吸出試管內(nèi)大部分水，僅留1cm高的水。加1mL 0.5%變色酸，混勻，再觀察顏色。陽(yáng)性反應(yīng)的結(jié)果：藍(lán)紫色，最低檢測(cè)限是0.25%。
　　1.3 生物蛋白精的快速定性檢測(cè)
　　蛋白精又叫蛋白胨，是一種脲醛樹(shù)脂聚合物（CO（NH2）2+CH2O），主要用于工業(yè)生產(chǎn)。生物蛋白精的最大特點(diǎn)是含氮量高（可達(dá)66%）、價(jià)格低。在飼料中少量摻入就可以迅速提高其“蛋白”含量。如果在飼料中，每增加1個(gè)百分點(diǎn)的生物蛋白精，會(huì)使用“凱氏定氮法”測(cè)定的表觀粗蛋白質(zhì)虛漲4個(gè)以上的百分點(diǎn)。生物蛋白精添加到飼料中，由于其本身沒(méi)有任何營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，不能被動(dòng)物所吸收，它們降低了飼料中真蛋白質(zhì)的含量，影響了動(dòng)物性能，甚至可能對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生危害。據(jù)有關(guān)研究表明，動(dòng)物若食用含有較高濃度“蛋白精”的飼料后，可以使動(dòng)物發(fā)生腎衰竭并導(dǎo)致死亡。
　　生物蛋白精的檢測(cè)方法：將樣品過(guò)45目篩，取一些篩下樣品加點(diǎn)滴板上，加0.5%二苯胺，覆蓋住樣品，在顯微鏡幾倍鏡下觀察結(jié)果。陽(yáng)性結(jié)果：漂浮著灰白色小顆粒，有時(shí)偏黃色，不光滑，表面好像是魚(yú)子樣的小突起狀的晶體，最低檢測(cè)限是0.1%。
　　1.4 三聚氰胺的快速定性檢測(cè)
　　三聚氰胺俗稱蜜胺，又稱氰尿酰胺、三聚氰酰胺，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，是重要的尿素后加工產(chǎn)品，其含氮量達(dá)66.88%左右（折合粗蛋白含量418%）。三聚氰胺是一種用途廣泛的有機(jī)化工原料，但在飼料中添加，不僅對(duì)養(yǎng)殖業(yè)具有不良影響，還對(duì)人類健康存在著嚴(yán)重威脅。三聚氰胺本身在劑量很低時(shí)是無(wú)毒的，但當(dāng)和三聚氰酸結(jié)合后能夠生成不溶于水的異氰尿酸蜜胺鹽，易引起腎結(jié)石，并具有致命性。
　　快速檢測(cè)三聚氰胺有兩種方法。
　　第1種方法：（0.5%二苯胺/奈斯勒試劑法）
　　樣品過(guò)45目篩，取一些篩下樣品加到點(diǎn)滴板上，加0.5%二苯胺，覆蓋樣品，在顯微鏡鏡下用低倍鏡觀察， 三聚氰胺是乳白色顆粒。
　　通過(guò)下面的方法確定三聚氰胺陽(yáng)性結(jié)果：
　　從脫脂的篩下樣品中挑出疑似的晶體，夾到點(diǎn)滴板上。加2滴75%H2SO4 ，等1min，再加5滴奈斯勒試劑，等3～5min，在顯微鏡下觀察顏色變化結(jié)果， 陽(yáng)性反應(yīng)的結(jié)果：亮橙色顆粒，最低檢測(cè)限是0.05%。
　　第2種方法：（三聚氰酸法）
　　僅動(dòng)物性原料
　　粗稱10g樣品于100mL小燒杯中，加30～40mL石油醚，充分?jǐn)嚢瑁葺腿?5min左右。然后把上清液倒掉，用濾紙過(guò)濾，收集脫脂樣品。把脫脂樣品放通風(fēng)櫥中，把石油醚揮發(fā)干凈。把樣品過(guò)45目，稱取4g樣品，將篩下樣品加到一個(gè)離心管中，加10mL 40%乙醇，蓋上蓋子，用震蕩器震蕩5min，150r/s，離心，3 000r/min，10min，用濾紙過(guò)濾，加1mL飽和三聚氰酸溶液，觀察反應(yīng)結(jié)果。陽(yáng)性結(jié)果：白色霧狀沉淀。最低檢測(cè)限：魚(yú)粉/魚(yú)頭粉/雞肉粉/豬肉粉 0.03%；魷魚(yú)肝臟粉 0.05%。
　　僅植物性原料粗稱5g樣品，樣品過(guò)45目，將篩下樣品放到一個(gè)試管中，加高氯仿至管口部位，萃取3～5min后，倒掉試管中的上浮物和高氯仿，管身傾斜將管內(nèi)壁的固體物一并倒棄，僅留2cm高氯仿即可。再倒入高氯仿少許，轉(zhuǎn)動(dòng)清洗內(nèi)壁面，片刻后將上面的液體吸出棄去，可反復(fù)清洗3～4次，管底部?jī)H留1mL或更少液體。將試管放烘箱或沸水浴上加熱將氯仿?lián)]發(fā)掉，沉淀干燥，將試管冷卻到室溫，加2mL蒸餾水。加1mL飽和三聚氰酸溶液（60℃左右），觀察反應(yīng)結(jié)果。陽(yáng)性結(jié)果：白色霧狀沉淀物產(chǎn)生，最低檢測(cè)限：菜籽粕/小麥谷朊粉 0.03%；玉米蛋白粉/豆粕/小麥面粉 0.05%。
　

　2 檢測(cè)結(jié)果
　　測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

　　

3 討論與結(jié)論
　　在傳統(tǒng)方法中尿素、銨鹽、硝酸鹽-亞硝酸鹽和尿醛聚合物的檢測(cè)用分光光度比色法。三聚氰胺檢測(cè)方法有試劑盒檢測(cè)法 （ELISA）、液相檢測(cè)法和氣質(zhì)檢測(cè)法。這些標(biāo)準(zhǔn)方法操作繁瑣、消耗大、試驗(yàn)周期性長(zhǎng)。本文中非蛋白質(zhì)含氮化合物快速檢測(cè)方法結(jié)合了感官檢測(cè)、顯微鏡檢測(cè)、物理、化學(xué)和生物學(xué)檢測(cè)，各種檢測(cè)方法相輔相成。在實(shí)踐中經(jīng)過(guò)多次和傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)常規(guī)檢測(cè)方法對(duì)比，上述檢測(cè)方法更簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、檢測(cè)結(jié)果直觀、技術(shù)易掌握，甚至非專業(yè)人員都可掌握，應(yīng)大力提倡。
　　作為飼料工作者尤其檢驗(yàn)人員應(yīng)對(duì)各種飼料原料生產(chǎn)工藝流程有一定了解，用上述方法快速檢測(cè)原料是否摻有非蛋白氮時(shí)，還應(yīng)注意其生產(chǎn)工藝中是否有殘留非蛋白質(zhì)含氮化合物，在實(shí)際快速檢測(cè)過(guò)程中還應(yīng)注意原料的假陽(yáng)性問(wèn)題，如玉米酒精糟中的銨鹽的假陽(yáng)性和加漿玉米皮中的銨鹽的假陽(yáng)性，一旦遇到此現(xiàn)象，一定要通過(guò)原料鏡檢、試劑鑒別、對(duì)比試驗(yàn)和空白試驗(yàn)來(lái)共同決定。用0.5%二苯胺檢測(cè)生物蛋白精和三聚氰胺時(shí)，在顯微鏡下鏡檢時(shí)要注意兩者的區(qū)別：兩者都為白色顆粒，但是生物蛋白精要比三聚氰胺發(fā)白，且用探針在顯微鏡下?lián)軇?dòng)顆粒時(shí)，三聚氰胺為完整顆粒不會(huì)散開(kāi)，而生物蛋白精用探針撥動(dòng)時(shí)會(huì)散開(kāi)。（作者：薛霖莉 李耀世）


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