第十四屆飼料商業配方師研習班問題集錦（一）

畜牧編輯

　
　第14屆飼料商業配方師研習班在上海成功召開，以下的問題來自討論環節的問題。

　　1.如何評估螯合微量元素效價？

　　傳統微量元素生物學效價是指動物從一種特定形式的微量元素化合物（如螯合物）中吸收利用該元素（如鋅）的程度。實際生產中，某種形式的微量元素的生物學效價常用測定其與該元素另一形式或“標準形式”的效價的比值來表示。在測定有機微量元素生物學效價的試驗中，常以微量元素無機鹽作為其標準形式，如硫酸鋅。目前微量元素生物效價的評估方法根據螯合元素的結構及其功能的不同，有多種方法，如組織含量測定法、斜率比法、微量元素依賴性生物標記法和元素的功效分析法等。組織中微量元素水平實際上反映的是組織中的儲存量，而不是吸收后輸送到特定組織的微量元素總量。通常，組織中微量元素的儲存量會受到排泄、利用或應激的影響。因此，測定組織中的微量元素只能反映部分情況。為了真實地反映生物學效價，需要通過多種方法來綜合測定產品的生物學效價很重要，僅通過一種方法測定是不全面的。如鋅的生物學效價，可通過測定脛骨中鋅的含量和小腸金屬硫蛋白mRNA 的表達量，以及體內與鋅相關酶的活性如SOD酶活等來綜合評估。

　　實際上，除了傳統的生物學效價定義，最近的研究結果顯示蛋氨酸羥基類似物螯合微量元素的優勢不僅限于吸收率高，例如可以增強免疫系統功能，減少脛骨的軟骨發育不良及足底組織損傷，減少腿部畸形（弓形腿，外翻足，顫抖腿）并增加骨強度，降低氧化應激和提高生長性能；而且螯合微量元素的應用，可以降低微量元素添加水平，節約礦產資源，減少環境污染，有如環保等諸多方面的效益，這些都是傳統效價評估所不能體現的。

　　2.氨基酸金屬螯合物的解離，pH降低時，平衡會出現左移金屬離子解離嗎？左移時隨著pH上升，會有什么變化？

　　氨基酸螯合鹽在溶液中會有解離平衡，這是一個動態平衡，有對應的穩定常數。在達到平衡態后，降低pH時（使環境呈酸性方向），溶液中H+增加，平衡向生成氨基酸的方向，金屬離子與氨基酸配體的解離會增加，游離金屬離子濃度增加；當達到平衡態后升高pH（使環境呈堿性方向），也會破壞原有的平衡，造成螯合物解離增加。

　　pH變化后，螯合物解離的程度與螯合鹽的穩定常數有關，穩定常數與所用的氨基酸配位體和微量元素都有關，同一種微量元素，不同的氨基酸，穩定常數不同；同一種氨基酸配位體，與不同金屬元素所得螯合鹽的穩定常數也不同。穩定常數低的解離多，穩定常數高的解離少。羥基蛋氨酸螯合微量元素穩定性好，解離的少。部分螯合物的穩定常數logK見下表1。

　　從表1的數據可以看到微量元素氨基酸螯合物的穩定常數都在103~6或103~10，而有機酸的穩定常數大于102，EDTA的穩定常數都大于1013，螯合物的穩定常數過低和過高都會影響動物的吸收和利用。同一種氨基酸與不同金屬元素形成的螯合物穩定常數亦有差別；金屬元素與氨基酸的摩爾比時穩定常數增大很多。動物試驗研究和實際生產效果都表明：羥基蛋氨酸螯合微量元素在單胃動物胃中的不易溶性，有利于螯合物保持穩定性，這種胃中不易溶解的特性并不影響微量元素在小腸中溶解吸收。

表1  部分螯合物的穩定常數logK

　　3.如何測氨基酸含量和微量元素含量？

　　根據配位體的組成和比例不同及微量元素的特性，可選用的方式有紅外光譜法、液相色譜法、原子吸收法、質譜儀、液質聯用，等多種方法。如羥基蛋氨酸螯合銅，可以采用傅立葉紅外光譜法，測定相關指紋峰的變化情況，與標準品所得的標準曲線對比，回歸分析得到氨基酸含量數據。

　　4.紅外光譜檢測的優缺點？

　　優點，直接，準確，重復性好，不需要液體狀態；

　　缺點，儀器設備昂貴，需要有純的結晶標準品。

　　5.怎樣區別真假螯合？

　　一般采用先定性再定量的方法。先用相應微量元素有機和無機態的理化特性，鑒別是有機還是無機，或通過較為復雜理化分析方法紅外光譜、示差測熱、X射線衍射可以鑒定螯合物產品和混合物。如觀察無機鹽和螯合鹽顏色的差異、溶解特性、用顯微鏡觀察產品結晶的不同，并結合定量鑒定分析來鑒別。 如：蛋氨酸鉻與無機鉻、無機鉻＋蛋氨酸，用甲醇提取后觀察提取液顏色，蛋氨酸鉻為紅紫色，無機鉻和無機鉻＋蛋氨酸為深綠色。

　　6.關于螯合率？農業部標簽？品控方法建立？

　　農業部標簽法的正式實施，有利于真假螯合微量元素的甄別。如果產品有可行可靠的測定方法證明產品是真正螯合微量元素，才允許在標簽上打“螯合”這一關鍵詞，只能用微量元素與氨基酸的混合物、復合物等關鍵詞，而不能用某氨基酸螯合微量元素。

　　對于品控方法的建立，可以按照前面的定性方法評估之后，確定為真正螯合的微量元素產品的情況下，再對其進行定量測定。定量測定的指標有氨基酸和微量元素含量及螯合率等。

　　重點和難點是螯合率的測定。螯合率是指有機微量元素產品中螯合元素量占總元素量的比例。在螯合物的實際應用中，人們經常把“螯合率”看作一種反應得率。檢測螯合率的方法目前有液體法和固體法兩種，其中液體法又分兩和種，一種是國標GB/T13080.2-2005中運用凝膠色譜法進行檢測，通過將氨基酸螯合物試樣在水中加熱、離心后，分成沉淀和溶液兩部分。溶液中所含的可溶性氨基酸鰲合物及金屬離子經過凝膠分離，在規定條件下洗脫，金屬離子形成氫氧化物沉淀，將固定在凝膠柱頂端無法洗脫，可溶性氨基酸螯合物則可通過配體氨基酸的攜帶從凝膠柱上洗脫下來，實現和金屬離子的分離;可溶性氨基酸螯合物洗脫分離完成后，加人EDTA溶液洗脫，使金屬離子從色譜柱上洗脫。用原子吸收光譜法測定沉淀態氨基酸螯合物、可溶性氨基酸螯合物及金屬離子的含量，分別計算出沉淀態氨基酸螯合物、可溶性氨基酸螯合物占金屬元素總量的比例即可計算出相應的氨基酸螯合物的螯合率。但是此方法在實際生產應用中檢測極不穩定，容易出現同一批樣品多次檢測結果不一致的現象。另外一種方法就是采用甘氨酸亞鐵國標中檢測甘氨酸進行評判，因為某一種特異性氨基酸螯合物中只存在一種氨基酸，如甘氨酸亞鐵中只存在甘氨酸，那么我們就可以檢測總甘氨酸的含量，再檢測游離甘氨酸的含量，用總甘氨酸的含量減除游離甘氨酸的含量，再除以總甘氨酸的含量就可以間接折算出螯合率。此種方法簡單易行，準確性高，適合飼料企業實驗室操作。

　　液體法針對的是溶解性好的螯合元素產品，主要是單體氨基酸螯合微量元素，如果是不溶或難溶的，用液體法難以測定螯合率，而且在液體在螯合鹽會有解離，且受環境中多種因素影響，溶劑的pH 值和濃度對礦物質螯合率的影響很大，會導致測定結果不準確。盡管微量元素體內研究已有一定基礎，但是在理想緩沖液中定量測定平衡螯合物的結果與體內真實環境相比，依然相差甚遠。消化系統內部并不是平衡狀態，除水和緩沖液，還有各種陰離子、陽離子、酶、氨基酸等成分。所以，體外液體狀態不能完全代表體內環境，因體內環境無法達到平衡狀態。該方法能測定螯合物的螯合率和溶液中樣品的螯合率，但不能測定固體樣品的螯合率。因此，液態狀態下的螯合率并不能反應原產品的螯合效果。

　　因此，固體狀態是測定螯合微量元素產品質量和均勻度的首選，特別是用于比較不同的固體有機微量元素產品時。通過檢測螯合程度，我們可以確定終產品的質量。為了獲得最精確的結果，產品應以固體狀態檢測。諾偉司開發并驗證了傅里葉紅外光譜法（FTIR），分析HMTBa與金屬元素結合的螯合物。該方法通過標準品曲線，能定量檢測出游離或未反應的HMTBa 含量，以及產品中螯合物的總量。


　　感謝諾偉司公司對答案的貢獻，在此表示感謝！