飼料專用低溫淀粉酶

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一種低溫α-淀粉酶的酶學性質研究

         

（ 杭州保安康生物技術有限公司，浙江杭州311508）

      

    摘要：經分離純化及誘變育種得到一株低溫α-淀粉酶高產菌株。研究結果表明，該菌株產生的酶是一種內切型淀粉酶，最適作用溫度為50℃，最適作用pH為5.2。該酶具有較好的耐熱性和耐酸性，經85℃高溫制粒，酶活存留率達88.1%；用pH4.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液處理4h后，酶活存留率達90%以上。體外模擬耐胃蛋白酶試驗，證明胃蛋白酶對該低溫α-淀粉酶無影響。對酶解產物進行分析，分子量集中在5000以下，比例達到70.26%。

      

    關鍵字：低溫α-淀粉酶；酶學性質        

      

    淀粉是單胃動物能量的主要來源，其供能占總能量需求的60%～80%。幼齡動物消化系統發育不成熟，淀粉酶分泌不足，限制了淀粉的消化吸收。隨著動物日糧配方的富營養化、飼養條件應激和環境污染問題越來越突出，成年健康動物添加“外源性營養消化酶”的作用也越來越明顯，意義也越來越大。通過添加外源性淀粉酶來提高飼料淀粉的消化吸收，對于提高動物生產性能、節約飼料資源意義重大[1]。

      

    目前飼料專用淀粉酶的研究開發較少，一般均采用食品加工、化纖、印染等工業用酶。中溫α-淀粉酶是飼料工業中應用最多的淀粉酶，其最適作用溫度為70℃～80℃，pH5.0以下失活嚴重。動物生理環境溫度—般為37℃～42℃，胃內pH較低，中溫淀粉酶在動物消化道內發揮作用甚微。低溫淀粉酶最適作用溫度比中溫淀粉酶要低20℃～30℃，因此研究開發低溫淀粉酶對飼料用酶而言，具有重要意義。

      

本研究對低溫淀粉酶的酶學性質進行了研究，旨在為飼料專用淀粉酶的開發提供依據。

      

1 材料和方法        

      

1.1 菌種 從采集到的樣品中分離純化并經誘變育種得到。

      

1.2 培養基        

      

固體發酵培養基

      

      麩皮50%，大豆粉25%，玉米粉15%，玉米芯7%，葡萄糖2%，酵母膏0.35%，MgSO4 0.04%，KH2PO4 0.1%，CaCl2 0.01%，NH4Cl 0.5%。

      

1.3 藥品和試劑

      

1.3.1 0.05 mol 硫代硫酸鈉：

      

13g Na2S2O3·5H20和0.1 g 無水碳酸鈉定容1000mL。

      

1.3.2 費林試劑

      

-----銅溶液：硫酸銅34.66 g 溶解在水中，定容至500 mL。

      

-----酒石酸鉀鈉堿溶液：酒石酸鉀鈉173 g 和氫氧化鈉50 g 溶解在水中，定容至500 mL。

      

-----使用前，精確地取等體積的銅溶液和堿液充分混合。

      

1.4 低溫淀粉酶活力的測定方法

      

將可溶性淀粉溶液10ml加到100mlErlenmyer三角瓶中，置于（40±0.5）℃恒溫水浴中。預熱10min-15min,加入樣品稀釋酶液1ml.準確加熱30min后。加入費林試劑4ml使酶失活。將三角燒瓶直接在煤氣噴燈（或電爐）上加熱2min后，立即放在自來水中冷卻。隨后，加入30%碘化鉀溶液2ml和25%硫酸溶液2ml，用0.05mol/L硫代硫酸鈉溶液滴定游離出的碘，以藍色小時作為滴定終點T30（ml）
  空白對照實驗：以水取代酶液。在另一個三角燒瓶中用上述同樣的操作步驟測定空白對照值T0(ml).臨近終點時，加入1%可溶性淀粉溶液1滴-2滴，以藍色消失作為滴定終點。

      

一個酶活力單位定義為1g固體酶粉（或1mL液體酶），于40℃、pH=5.0條件下，反應30min，反應液中產生相當于10mg葡萄糖的還原糖所需的酶量。

      

淀粉酶活力（u/ml）=（T0-T30）×f×1.62×1/10×n

      式中：T30----酶反應液滴定消耗硫代硫酸鈉標準溶液的體積，ml
   T0----空白溶液滴定消耗硫代硫酸鈉標準溶液的體積，ml
   f----0.05mol/l硫代硫酸鈉溶液濃度的校正系數
   1.62----換算系數
   1/10----該分析方法的常數（相當于10mg葡萄糖的還原糖）
   n----樣品的稀釋倍數      

2 實驗結果

      

2.1 產酶菌株的發酵培養與活力檢測

      

    將經過篩選和育種得到的菌株接入固體發酵培養基中，30℃培養50h。烘干、粉碎后測定低溫淀粉酶活力，酶活最高達3820U/g。

      

2.2 酶學性質的研究        

      

2.2.1 低溫淀粉酶作用溫度的研究

      

在pH5.0 的酶活測定反應體系中，分別在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃溫度下測定酶活，溫度對酶活的影響如圖1。

                                                

                                                        圖1 溫度對酶活的影響

      

Fig.1 The effect of temperature on relative activity

      

    由圖可知，該低溫淀粉酶最適作用溫度為50℃，在35～60℃之間均有較高的酶活。

      

2.2.2 低溫淀粉酶的最適作用pH

      

在40℃的酶活測定反應體系中，分別調節pH為2.2、2.5、3.0、3.5、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，按照低溫淀粉酶的酶活力測定方法測定酶活，測定結果如圖2所示。

                                                                           
                                         

圖 2 pH對酶活的影響

      

Fig.2 The effect of temperature on relative activity

      

由圖可知，該低溫淀粉酶最適作用pH為5.2，在pH4.0～6.0之間均有較高的酶活。

      

2.2.3 酶的熱穩定性

      

     為了準確評估低溫淀粉酶經飼料高溫制粒后的實際存留率，本試驗在飼料中添加20%的淀粉酶，然后進行85℃高溫制粒后進行評估，試驗結果見圖3。

                                       

圖 3 酶的熱穩定性

      

Fig.3 Thermal stability of enzyme

      

由圖3可知，制粒前低溫淀粉酶理論值為624U/g，實際檢測值為603U/g，經過85攝氏度制粒后酶活為531 U/g ，酶活存留率達到88.1%，說明在高溫制粒過程中低溫淀粉酶具有較好的耐受性能，適用于飼料制粒工藝。

      

2.2.4低溫淀粉酶的耐酸性評估

      

將制得的酶液分別用pH3.5、4.0、4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液處理0h、1h、2h、3h、4h，測定淀粉酶活力，結果如圖四所示。

            

圖 3低溫淀粉酶的耐酸性

      

Fig.4 Acid resistance of enzyme

      

     用pH3.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液處理4h后，淀粉酶活力存留80%以上，經pH4.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液處理4h后，淀粉酶活力存留90%以上，說明該淀粉酶耐酸性良好。

      

2.2.5 體外模擬耐胃蛋白酶實驗

      

     模擬動物體內生理環境溫度40℃，加入1mg/mL的新鮮胃蛋白酶鹽溶液（0.1N，pH3.5），處理5h，每隔1h測定淀粉酶活。

            

圖 5 耐胃蛋白酶實驗

      

Fig.5 Resistance to pepsin experiment

      

由圖可知，在pH3.5、溫度40℃、用1mg/mL的胃蛋白酶溶液處理淀粉酶5h后，淀粉酶活力存留仍在80%以上。

      

2.2.6 HPLC對酶解產物的分析

      

取一定量5%的淀粉溶液，預熱保溫40℃，加入一定量的低溫淀粉酶，控制反應時間為30min，然后沸水浴5min使酶失活，微孔膜過濾后，利用HPLC分析樣品中各物質的分子量分布，圖譜峰見圖6。

                                                                     

保留時間	重均	重均/數均	%
8.055	4539	1.34742	52.7026
8.643	1586	1.00603	10.1598
8.955	1245	1.00315	6.3192
9.295	1015	1.00207	1.0784

      

圖5 低溫淀粉酶酶解產物HPLC圖譜

      

Fig.6 HPLC analysis of starch solution by cold-adapted amylase

      

    從圖譜可看出，低溫淀粉酶酶解產物分子量多集中于5000以下，占酶解物總量的70.26%。

      

3 結論與討論

      

    通過分離純化篩選到的菌株，產淀粉酶活力能夠達到3820U/g，同國內報道的低溫淀粉酶菌株相比，具有較高的研究應用價值[9,10]。該淀粉酶是一種內切型α-淀粉酶，最適反應溫度為50℃，最適作用pH為5.2，在pH4.0～6.0之間具有較高活性；該低溫淀粉酶有較好的耐酸性和耐熱性，用pH4.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液處理4h后，淀粉酶活力存留90%以上，經過85℃高溫制粒后，酶活存留率為88.1%。采用體外模擬耐胃蛋白酶試驗，證明胃蛋白酶對其無影響。

      

    從酶學性質分析，該菌株生產的低溫α-淀粉酶適合動物消化道環境條件，能夠耐受高溫制粒，在飼料行業有很大的應用前景。

      
      

參考文獻

      

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[3]   趙百鎖，楊禮富，宋蕾，等中度嗜鹽菌在生物技術中的應用［J］微生物學通報，2007，34(2)：1-8.

      

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[11]   Glbson K. The importance of detergent amylases for whiteness maintenance[J]. Riv Ital Sostanze Grasse, 1998, 75(4): 207–211.