花生粕中胰蛋白酶抑制因子和皂苷含量調查

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　　導語

　　花生粕(Peanut meal)是以脫殼花生果為原料，經提取油脂后得到的副產品。其中蛋白質含量達48.68%，多糖含量達32.50%，并含有Mg、K 等多種礦物質元素，但氨基酸種類不平衡。隨著養殖業的迅猛發展，魚粉需求量大幅度增加，供應量嚴重不足，用其他蛋白質原料替代魚粉成為畜禽及水產飼料營養研究的熱點。我國花生總產量居油料作物首位，但因其易感染黃曲霉毒素，同時含有影響動物對營養物質消化、吸收及代謝的抗營養因子，主要有胰蛋白酶抑制因子(Trypsin inhibitor，TI)和皂苷(Saponin，S)等，限制其在畜禽水產中的應用。其中，胰蛋白酶抑制因子可以和小腸中的胰蛋白酶及糜蛋白酶結合，形成穩定的復合物，使酶失活，導致蛋白質消化率和利用率降低，動物生長遲緩，飼料轉化率降低。皂苷則易增加畜禽腸黏膜細胞的通透性，抑制活性營養的運輸，破壞腸細胞結構，與鞣質會形成復合物，毒性增強，還會和鋅離子形成不溶復合物，降低鋅的吸收率。目前，花生粕中的胰蛋白酶抑制因子和皂苷含量尚未被調查，鑒于花生品種、制油工藝、操作條件、設備、技術水平的差異，制油之后的花生粕中抗營養因子含量也不盡相同，因此本文闡述花生粕中兩種抗營養因子含量范圍，并參照豆粕中皂苷提取方法對花生粕中皂苷提取方法中乙醇體積分數、料液比、超聲時間、超聲溫度和超聲功率進行單因素優化，從而獲得花生粕中皂苷的最佳的提取方法。

　　1 材料與方法

　　1.1 儀器與試劑

　　酶標儀（Power Wave Xs2美國BioTek公司）、旋轉蒸發儀（RE-2000，上海某生化儀器廠）、高功率數控超聲波清洗器（KQ-400KDE，昆山市某儀器有限公司）、雙層恒溫培養振蕩器（SPH-2012C，上海某設備有限公司）、恒溫水浴箱（SB-9，日本EYELA公司）、高速離心機（Hitachi 公司，日本）。胰蛋白酶抑制因子定量檢測試劑盒購自北京某生物工程技術有限公司，齊墩果酸標準品（純度為99%）購自上海某科技公司，試驗用水為Millipore 純水系統（美國Millipore 公司）制得的高純水，乙醇、冰醋酸、香草醛、高氯酸為分析純。

　　1.2 樣品來源

　　采集來自山東省知名花生油、食品、油脂、飼料及其他企業的21批次(使用環節)的花生粕，其中5批次采用浸提法，剩余均為壓榨工藝。

　　1.3 樣品測定方法

　　1.3.1 胰蛋白酶抑制因子的測定

　　ELISA測定參照產品說明書。具體過程如下：將待檢的花生粕粉碎成60目以上顆粒，稱取0.100 g樣品于50 ml離心管中，加入30 ml提取液，于25 ℃振蕩16 h，靜置2 min后，4 000 r/min的速度離心5 min，取上清液用稀釋工作液稀釋300倍。將樣品盒標準品對應微孔按序編號，每個樣品和標準液平行測定兩次，記錄校準孔和樣品孔所在的位置，經過加樣、洗板、加酶標試劑、顯色，加終止液后于450/630 nm雙波下讀取吸光度值。

　　吸光率(%)=B/B0×100。

　　式中：B——校準品或樣品的平均吸光度值；B0——標準品1的平均吸光度值。

　　校準曲線的繪制：以校準品百分吸光率為縱坐標，以校準品濃度的對數為橫坐標，繪制標準曲線。

　　1.3.2 皂苷的測定方法

　　1.3.2.1 繪制標準曲線

　　稱取齊墩果酸標準品5.0 mg，定容到50 ml，用甲醇（HPLC）配制0.1 mg/ml 的標準儲備液。精密吸取齊墩果酸標準溶液0、100、200、300、400 μl及500 μl分別于10 ml離心管中，在50 ℃下氮氣吹干，在試管中加入新配制的質量分數5%香草醛-冰醋酸溶液（稱取5 g香草醛加入100 ml冰醋酸中充分溶解）0.2 ml，高氯酸0.8 ml，置于60 ℃水浴上加熱15 min，流水冷卻，加冰醋酸5 ml，混勻，酶標儀波長547 nm處測量OD值。以齊墩果酸含量為橫坐標，吸光值為縱坐標做標準曲線。

　　1.3.2.2 花生粕中皂苷提取方法的優化（見表1）

　　樣品提取參照阮洪生等對豆粕中皂苷提取方法，并在實驗室條件下進行單因素優化。對花生中皂苷的超聲時間、提取液濃度（乙醇：水）、料液比、超聲溫度及超聲功率進行單因素試驗優化。鑒于前人研究不對提取次數進行優化，提取次數均為2次。表1為花生粕中皂苷前處理條件的單因素優化及結果。通過對試驗結果不同處理組進行單因素方差分析，提取方式中超聲1 h與2 h差異不顯著(P>0.05)，但均顯著高于超聲3 h處理組，考慮充分提取選取2 h，若時間有限可選取1 h；提取液體積分數(乙醇：水)為70：30和80：20組的提取率顯著高于90：10處理組，發現提取液體積分數為80：20時提取率最高；料液比1：25時提取率較低，另外兩組的提取率差異不顯著(P>0.05)，其中料液比為1：20時提取率最高；超聲溫度70 ℃和80 ℃的提取率差異不顯著(P>0.05)，且均顯著高于60 ℃組，其中超聲溫度70 ℃提取率最高。超聲功率70%和80%的提取率顯著高于60%處理組，考慮到超聲功率較高會引起超聲溫度變化，并且超聲功率為70%時皂苷含量高于80%，因此選用70%的超聲功率。最終確定的前處理方法如下：稱取一定質量粉碎后的花生粕，按照1：20 的料液比加入體積分數為80%的乙醇溶液，超聲浸提2 h，超聲溫度和功率分別為70 ℃和70%。冷卻室溫后4 000 r/min離心10 min，轉移上清液后，重復上述步驟，合并兩次上清液，旋轉蒸發至5~10 ml，用去離子水定容至25 ml，渦旋混勻，取200 μl提取液加入10 ml離心管中，50 ℃下氮吹，后續步驟與1.3.2.1氮吹之后的步驟一致。

　　1.4 數據處理與分析

　　采用SPSS 19.0、Excel 2013及酶標軟件。

　　2結果

　　2.1 花生粕中胰蛋白酶抑制因子含量(見表2)

　　由表2 可知，花生粕中TI 平均含量為（2.41±1.21） mg/g，實測值范圍為0.73~4.88 mg/g，選擇P5（5%的含量小于該值，下同）~P95（95%的含量小于該值，下同）為置信區間，含量范圍為0.94~4.80 mg/g。其中5 批次經浸提工藝的樣品TI 含量范圍為1.27~4.88 mg/g，其余經壓榨工藝的樣品TI 含量范圍在0.73~4.80 mg/g內，表明壓榨之后TI含量雖最低，但兩種方式的工藝下的TI含量最高水平一致，從而表明TI含量不僅與制油工藝相關，也可能與花生品質、加工參數相關。但浸提法下的均值水平[（2.78±1.32）mg/g]高于壓榨方式下的TI均值水平[（ 2.29±1.20）mg/g]，從而表明壓榨法較浸提法能較大程度消除TI。

　　2.2 花生粕中皂苷含量(見表2)

　　由表2 可知，花生粕中皂苷平均含量為（7.20±0.18）mg/g，實測值范圍為5.74~11.43 mg/g，P5~P95 含量范圍為5.78~9.01 mg/g。浸提和壓榨工藝下的花生粕中皂苷含量范圍分別為5.74~7.67 mg/g 和5.78~11.43 mg/g，均值含量分別為(6.63±0.82) mg/g和(7.38±1.38) mg/g，浸提法較壓榨法在含量范圍和均值較低，表明浸提法較壓榨法去除皂苷程度大。

　　2.3 花生粕中兩種抗營養因子含量比較

　　由表2發現，皂苷含量整體高于胰蛋白酶抑制因子含量，花生粕中皂苷含量變異水平低于胰蛋白酶抑制因子，說明現在的制油水平的差異對胰蛋白酶抑制因子影響較大。另外，對花生粕中胰蛋白酶抑制因子和皂苷含量進行線性相關性分析發現，二者之間相關性不顯著。

　　3討論

　　3.1 花生粕中胰蛋白酶抑制因子結果分析

　　羅虹等對鮮食花生中的TI進行提取并對其活性進行了測定，活性范圍在0.062%~0.451%之間，與本調查中花生粕含量范圍接近，表明花生經制油后其內TI沒有被大量消除，其原因在于花生TI具有極度耐熱性，這與花生TI粗提物經100 ℃水浴15 min，殘留活性為對照(25 ℃)的77%；100 ℃水浴1 h，殘留活性為對照的68%研究結果一致。李素芬等的研究顯示，肉仔雞飼喂TI 含量最高的生大豆組(4.65%TI/CP)胰腺腺管上皮組織具有明顯的增生性變化，細胞體積增大和數量稍有增多，并伴有空泡樣變性；隨著TI濃度的下降，胰腺腺管細胞增生現象也減輕，且日糧中TI/CP在0.2%~1.97%時飼喂仔雞胰腺并未出現明顯變化。而參照花生粕中粗蛋白質45%計算，花生粕中TI/CP 在0.2%~1.07%，故不會對肉仔雞產生危害。另外，本研究中花生粕中TI低于豆粕（2.2~61.6 mg/g），也低于發酵豆粕[（ 7.5±7.6）mg/g]和膨化豆粕[（ 18.3±2.3）mg/g]中的平均水平。

　　3.2 花生粕中皂苷結果分析

　　由檢測結果可知，花生粕中皂苷含量低于豆科植物皂苷含量范圍18~41 mg/g，其原因是加工處理過程中皂苷類化合物會降解流失。孫健在加工方法對菜豆中主要皂苷的影響研究中表明：熱處理（高溫烹煮、高壓滅菌）會導致豆中主要皂苷含量顯著流失，同時，皂苷含量<1 g/kg時不會影響主要養殖魚類。根據本研究結果，在魚類養殖中建議花生粕使用量不超過17%。劉襄河在飼料中用花生粕替代魚粉比例達28.6%（花生粕添加量為14%）時，不影響凡納濱對蝦的生長性能、飼料利用率及其免疫功能，因此，本研究中花生粕測定范圍為正常范圍。單胃動物對皂苷反應不同，雞比其他單胃動物敏感，日糧中皂苷含量為0.15%可降低肉仔雞生產性能及產蛋率。按照本研究花生粕中皂苷含量范圍，不考慮霉菌污染，花生粕使用范圍為19.56%~26.13%。

　　花生粕中皂苷含量（0.578%~0.901%）與大豆餅中皂苷含量水平一致（0.6%~0.9%），高于菜豆莢中皂苷含量（0.097%~0.786%）。苜蓿中含有豐富的皂苷，根部平均含量在1.335%，大于莖(0.596%)和葉(0.655%)中，與花生粕中皂苷平均水平一致，從而表明花生粕中皂苷含量不容小覷。

　　4 結論

　　本研究采集山東省市售使用環節中的21批次花生粕，其中胰蛋白酶抑制因子在0.94~4.80 mg/g含量范圍內，含量較低，但不同動物對其耐受性評價有待研究。皂苷含量范圍為5.78~9.01 mg/g，高于胰蛋白酶抑制因子，可能是限制花生粕在飼料中應用繼霉菌毒素之后的第二因素。浸提法比壓榨法制油后的花生粕中胰蛋白酶抑制因子含量高，皂苷含量低。這兩種抗營養因子含量之間相關性不顯著；同時，花生粕中皂苷含量高于胰蛋白酶抑制因子含量。該研究數據將有助于了解現行市場中花生粕抗營養因子含量水平，引起飼料企業、制油企業和養殖企業對花生粕中抗營養因子的重視，為花生粕在畜禽水產養殖中的合理使用提供指導意義。

　　來源：飼料工業