酵母水解物中甘露聚糖的檢測

畜牧人市場部2

      酵母生物技術(shù)和碳水化合物化學(xué)的研究進展為解決霉菌毒素問題提供了新方法。研究發(fā)現(xiàn), 存在于酵母細胞外壁的功能型碳水化合物———甘露聚糖對霉菌毒素有很強的吸附能力。人們進一步發(fā)現(xiàn), 酵母細胞能通過吸收毒物和病原菌到細胞壁上來改善動物健康。根據(jù)這一研究, 甘露聚糖成為新型霉菌毒素吸附劑研究的重點, 被認為是具有很大開發(fā)價值的天然綠色添加劑。

　　酵母甘露聚糖逐漸被各個飼料企業(yè)及配方專家們所肯定及應(yīng)用，但如何選擇優(yōu)質(zhì)的酵母甘露聚糖產(chǎn)品？如何測定甘露聚糖含量？

　　酵母甘露聚糖的含量

　　甘露聚糖是一種有分支的聚合物，主鏈以α-1,6糖苷鍵結(jié)合，支鏈以α-1,2或α-1,3糖苷鍵結(jié)合，約占酵母細胞壁干重的30%。

　　針對目前市場上的酵母甘露聚糖產(chǎn)品，我們推薦酵母水解物中甘露聚糖的含量應(yīng)≥10%；

　　酵母細胞壁中甘露聚糖的含量應(yīng)≥20%，總多糖≥45%。

　　酵母甘露聚糖的檢測

　　1.原理

　　基于甘露糖在流動相和液相色譜柱的固定相之間具有不同的分配系數(shù)，將水解后的樣品注入液相色譜，用純水做流動相，糖類分子流出后，經(jīng)示差檢測器檢測，用外標法定量。

　　在甘露聚糖水解時，由于樣品可能存在水解不徹底，以及水解產(chǎn)生的葡萄糖和甘露聚糖由于其他高溫造成部分發(fā)生其他副反應(yīng)，導(dǎo)致檢測結(jié)果比產(chǎn)品中實際含量偏低。檢測中采用葡聚糖對上述水解過程引起的誤差進行修正。

　　2.儀器

　　1) 水浴鍋；
　　2) 旋渦混合器；
　　3) 電爐；
　　4) 壓力蒸汽滅菌器；
　　5) 高效液相色譜儀：帶示差檢測器和糖柱（6.5 mm×300 mm，waters sugar pak-1）。

　　3.試劑

　　1) 純水；
　　2) 鹽酸：37%左右；
　　3) 甘露糖：標準品；
　　4) 氫氧化鈉：AR；
　　5) 甘露糖標液（2 g/L）：稱取甘露糖0.2000 g，用純水定容至100 ml。
　　6) 葡聚糖對照品（curdlan from Alcaligenes faecalis）: Sigma產(chǎn)品，貨號C7821。
　　7) 氫氧化鈉溶液：300 g/L。

　　4.操作步驟

　　4.1樣品處理

　　準確稱取400 mg(精確至0.1 mg)樣品放入一個20 ml的耐熱玻璃制的帶螺帽的小試管中，加入6.0 ml鹽酸（37%），小心的將小瓶蓋緊后用漩渦混合器混合，得到均一的懸浮液。將小瓶放入30 ℃水浴中處理45 min，每15 min用漩渦混合器震蕩混合一次。然后將懸浮物定量的轉(zhuǎn)移到200 ml杜氏瓶中，用約100~200 ml的水，分幾次洗滌小試管，洗滌液并入杜氏瓶中。將杜氏瓶放入高壓滅菌鍋，121 ℃下處理60 min.取出后冷卻，用氫氧化鈉溶液調(diào)將溶液調(diào)PH到6~7，然后定容至200 ml。使用0.45 μm孔徑的醋酸纖維素膜過濾備用。

　　同時準確稱取葡萄糖對照品200 mg，按樣品處理方法進行同樣的處理。

　　4.2 色譜條件

　　采用純水作為流動相，流速為0.5 ml/min，柱溫80℃，待儀器基線平穩(wěn)后再進樣。

　　4.3標準曲線的繪制

　　分別吸取甘露糖標液1、2、3、4、5 ml到10 ml容量瓶中，用高純水定容到刻度，得到甘露糖為200、400、600、800、1000 mg/L的標樣。在上述色譜條件下準確進樣20 μl，得到色譜峰面積和標準物質(zhì)質(zhì)量濃度之間的回歸方程，繪制標準曲線。

　　4.4樣品及對照品的測定

　　在同樣的色譜條件下，將處理好的樣品和葡聚糖對照品分別注入色譜儀中，記錄各色譜峰的保留時間和峰面積。用糖標樣色譜峰的保留時間定性，用糖標樣色譜峰的峰面積來定量。

　　5.計算結(jié)果

　　甘露聚糖的含量按下式計算：

  式中：



　　式中：

　　X—樣品中甘露聚糖的含量，%；
　　A1—根據(jù)樣品溶液的峰面積，在標準曲線上查得的樣品溶液的甘露糖的含量，mg/L；
　　A2—根據(jù)葡聚糖對照品溶液的峰面積，在標準曲線上查得的樣品溶液的葡萄糖的含量，mg/L;
　　m1-—稱取樣品的質(zhì)量，g;
　　m2—稱取葡聚糖對照品的質(zhì)量，g;
　　0.2—樣品/葡聚糖對照品處理后定容的體積，L；
　　0.9—將甘露糖換算成甘露聚糖的系數(shù)；
　　F—樣品酸水解中葡萄糖和甘露糖被破壞造成結(jié)果偏低的經(jīng)驗補償系數(shù)；
　　P—葡聚糖對照品的純度（依據(jù)試劑廠家提供的檢驗報告）；
　　W—葡聚糖對照品的水分（依據(jù)試劑廠家提供的檢驗報告）；
　　備注：在同一個實驗室內(nèi)，一般1~2個月檢測F值即可。F值在1.25左右，實驗室定期對F值進行修正。

　　6.誤差分析

　　在重復(fù)性檢測條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的相對偏差不得超過下表中所規(guī)定的數(shù)值：

來源：海宜動物營養(yǎng)公眾微信號